傅春燕，周丹珺，陸 焰，劉冰冰，楊文鴿*

(寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211)

響應(yīng)面法優(yōu)化鮐魚(yú)頭酶解條件

傅春燕，周丹珺，陸 焰，劉冰冰，楊文鴿*

(寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211)

以鮐魚(yú)頭為原料，水解度為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)，比較中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對(duì)鮐魚(yú)頭的酶解效果，并進(jìn)一步對(duì)風(fēng)味蛋白酶的酶解工藝參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化。結(jié)果表明：風(fēng)味蛋白酶的酶解效果最好，其加酶量、酶解溫度和時(shí)間對(duì)水解度均有極顯著影響(P＜0.01)；響應(yīng)面法優(yōu)化得到鮐魚(yú)頭酶解的最適條件為風(fēng)味蛋白酶添加量1311U/g、酶解溫度46℃、反應(yīng)時(shí)間7h，鮐魚(yú)頭的水解度達(dá)到31.18%。

響應(yīng)面；鮐魚(yú)頭；酶解；水解度

鮐魚(yú)(Pneumatophorus japonicns)，又名青鲇魚(yú)，是海洋中上層低值魚(yú)類(lèi)，在我國(guó)各海域均有分布，尤以東海產(chǎn)量最多。鮐魚(yú)也是我國(guó)重要的加工魚(yú)種，每年加工成各類(lèi)冷凍魚(yú)片和魚(yú)罐頭數(shù)量達(dá)萬(wàn)噸[1]，而加工產(chǎn)生的魚(yú)頭、魚(yú)骨和內(nèi)臟往往成了水產(chǎn)品下腳料。這些下腳料一般加工成魚(yú)粉或直接作為廢物處理，高值化利用程度較低，因此開(kāi)發(fā)利用鮐魚(yú)加工下腳料具有重要意義。

研究表明：腸道能有效吸收蛋白水解物，尤以三肽吸收為最好[2]。另外，低分子肽不僅是重要氮源[3]，還具有眾多生理功能，如降血壓[4]、抗氧化[5]、提高免疫力[6]、防腐和抑菌等作用[7]。因此，酶解魚(yú)品下腳料以獲得較高價(jià)值的多肽類(lèi)物質(zhì)已成為目前的研究熱點(diǎn)。Guerard等[8]利用中性蛋白酶酶解鮪魚(yú)下腳料，以制備魚(yú)蛋白粉；Bougatef等[9]酶解沙丁魚(yú)頭與內(nèi)臟，以提取活性多肽。本實(shí)驗(yàn)利用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶以及風(fēng)味蛋白酶對(duì)鮐魚(yú)頭進(jìn)行酶解，篩選到合適的酶種類(lèi)，并對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，以獲得易消化吸收的酶解液，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用鮐魚(yú)頭資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鮐魚(yú)(P. japonicns)采自3～4月，每尾質(zhì)量(200 ±20)g，購(gòu)于寧波水產(chǎn)大世界，取鮐魚(yú)頭，經(jīng)高速組織搗碎機(jī)搗碎均勻，凍藏備用；木瓜蛋白酶(11.8萬(wàn)U/g)廣西南寧龐博生物工程有限公司；中性蛋白酶(19.1萬(wàn)U/g)、風(fēng)味蛋白酶(2.2萬(wàn)U/g) 無(wú)錫市雪梅酶制劑科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BP221S型電子分析天平、Docu pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司；Biofuge Stratos高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Thermo

Fisher Scientific公司；XHF-1型內(nèi)切式勻漿機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；JB-3型定時(shí)恒溫磁力攪拌器上海雷磁儀器廠；DS-1型高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠。

1.3 方法

1.3.1 一般營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

水分：105℃烘干法；總蛋白量[10]：半微量凱式定氮法；脂肪含量[11]：氯仿-甲醇法；灰分：550℃灼燒法。

1.3.2 鮐魚(yú)頭酶解液的制備流程

鮐魚(yú)頭→搗碎均勻→加入一定比例的水?dāng)嚢杈鶆颉附狻鷾缑?沸水浴10min)→冷卻→離心→取上清液→水解度測(cè)定

1.3.3 水解度的測(cè)定

以甲醛電位滴定法測(cè)定氨基酸態(tài)氮；水解度(DH)計(jì)算公式如下：

DH/%=(酶解液中的氨態(tài)氮總量－原料中本身含有的氨態(tài)氮總量)/原料中總氮含量×100

1.3.4 蛋白酶活力的測(cè)定

Folin-酚法[12]測(cè)定蛋白酶活力。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.1.3軟件，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3～5個(gè)平行樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮐魚(yú)頭原料的一般營(yíng)養(yǎng)成分

表1 鮐魚(yú)頭的一般營(yíng)養(yǎng)成分Table1 The basic nutritional components of P. japonicns heads

由表1可以看出，鮐魚(yú)頭水分含量為64.36%，相對(duì)較高，不易保藏；其粗蛋白質(zhì)含量達(dá)13.63%，是一種很好的蛋白質(zhì)資源，值得開(kāi)發(fā)利用。

2.2 鮐魚(yú)頭酶解工藝的單因素試驗(yàn)

2.2.1 加酶量的確定

取鮐魚(yú)頭原料，添加2倍質(zhì)量的水，50℃保溫5min后，分別加入0.6×103、0.8×103、1.0×103、1.2 ×103、1.4×103、1.6×103、1.8×103、2.0×103U/g原料的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶，50℃酶解7h，立即終止酶反應(yīng)。取樣測(cè)定其水解度，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 加酶量對(duì)鮐魚(yú)頭水解度的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on the DH of P. japonicns heads

由圖1可知，當(dāng)加酶量從0.6×103U/g遞增到1.0× 103U/g，3種酶的水解效果均不斷增加，但超過(guò)1.0× 103U/g后，水解度增加不明顯。中性蛋白酶添加量1.0× 103U/g時(shí)，水解度達(dá)到最大13.03%，隨后甚至有所下降；木瓜蛋白酶的水解度隨著酶添加量的增加不斷增加，但增加量不大；3種酶中風(fēng)味蛋白酶的水解效果最好，添加量達(dá)1.2×103U/g時(shí)水解度最大。這與洪鵬志等[13]對(duì)研究黃鰭金槍魚(yú)頭酶解條件得到的結(jié)論相似，中性蛋白酶、風(fēng)味酶在酶添加量超過(guò)1.4×103U/g原料后，木瓜蛋白酶在酶添加量超過(guò)1.1×103U/g原料后，水解效果已趨于平緩。原因在于隨著酶量的增加，酶已逐漸被底物所飽和，酶促反應(yīng)速度趨向最大值。

2.2.2 酶解溫度的確定

取鮐魚(yú)頭原料，添加2倍質(zhì)量的水，分別在40、45、50、55、60℃保溫5min后，加入1.0×103U/g原料的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或風(fēng)味蛋白酶，在各溫度條件下酶解7h。取樣測(cè)定其水解度，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 溫度對(duì)鮐魚(yú)頭水解度的影響Fig.2 Effect of temperature on the DH of P. japonicns heads

從圖2可以看出，由40℃升至50℃，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解效果不斷增強(qiáng)，但超過(guò)50℃后，水解度下降；風(fēng)味蛋白酶在45℃時(shí)水解度達(dá)到最高，45℃到50℃水解度有所下降但幅度不大，55℃后水解度大幅度下降。溫度的提高在一定程度上能提高一般化學(xué)反應(yīng)的速率，但酶是一種活性蛋白，超過(guò)一定溫度后會(huì)使

其失去部分催化活性，從而降低酶促反應(yīng)速率。由圖可知，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶的最適溫度分別是50、50、45℃。

2.2.3 酶解時(shí)間的確定

取鮐魚(yú)頭原料，添加2倍質(zhì)量的水，50℃保溫5min后，分別加入1.0×103U/g原料的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶，5 0℃酶解1、2、3、4、5、6、7h，立即終止酶反應(yīng)。取樣測(cè)定其水解度，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)鮐魚(yú)頭水解度的影響Fig.3 Effect of time on the DH of P. japonicns heads

由圖3可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，3種酶的水解度均有不斷提高，特別是在最初的1h，增加速度最明顯。中性蛋白酶和木瓜蛋白酶在1h后的水解度增加幅度遠(yuǎn)小于風(fēng)味蛋白蛋白酶，風(fēng)味蛋白酶在5h之前的水解度都在迅速增加，隨后趨于平緩。洪鵬志等[13]研究表明時(shí)間對(duì)木瓜蛋白酶的酶解效果影響不大，在4h之內(nèi)中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的水解效果均隨著時(shí)間的增加而增強(qiáng)；侯溫甫等[14]研究得到淡水魚(yú)頭酶解時(shí)的最佳酶解時(shí)間為5h，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相近。

2.2.4 料液比的確定

取鮐魚(yú)頭原料，按原料質(zhì)量的1、2、3、4、5、6倍添加水，使料液比分別達(dá)到1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6(g/mL)，50℃保溫5min后，分別加入1.0×103U/g原料的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶，50℃酶解7h，立即終止酶反應(yīng)。取樣測(cè)定其水解度，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 料液比對(duì)鮐魚(yú)頭水解度的影響Fig.4 Effect of water dosage on the DH of P. japonicns heads

由圖4可知，中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶在1:1(g/mL)時(shí)水解度較低，1:2(g/mL)時(shí)達(dá)到最大，1:2～1:6(g/mL)變化時(shí)，中性蛋白酶的水解效果有所下降，風(fēng)味蛋白酶的水解效果有上下波動(dòng)，但變化不大；而木瓜蛋白酶的水解效果在料液比1:1、1:2(g/mL)時(shí)最大，而后有所降低，與相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果相符。周濤等[15]在研究鮐魚(yú)廢棄物酶解條件時(shí)得到的最佳料液比為5:8(g/mL)；段振華等[16]在研究鳙魚(yú)下腳料的酶解時(shí)也發(fā)現(xiàn)當(dāng)料液比從1:1(g/mL)減小到1:2(g/mL)時(shí)，水解效果上升最快，而后變緩。因?yàn)楫?dāng)反應(yīng)體系中水分增加時(shí)，降低了反應(yīng)產(chǎn)物的濃度，減輕了產(chǎn)物對(duì)酶促反應(yīng)的反饋抑制作用；而水分進(jìn)一步增加降低酶濃度，導(dǎo)致了水解效果的下降。

由單因素試驗(yàn)可以看出，風(fēng)味蛋白酶在3種酶中的酶解效果最好，最佳反應(yīng)條件約為酶添加量1.2×103U/g原料、反應(yīng)溫度45℃、反應(yīng)時(shí)間6h、料液比為1:2 (g/mL)，水解度可達(dá)30%以上，而中性蛋白酶與木瓜蛋白酶的水解度均在15%以下。因此選取風(fēng)味蛋白酶，并進(jìn)一步對(duì)酶解工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.3 風(fēng)味酶酶解鮐魚(yú)頭的響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平的選取

參考單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面方法在三因素三水平上對(duì)酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化因素與水平Table2 Factors and levels of the experiment

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方案及結(jié)果Table3 Experimental design and results of the experiment

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析和酶解各因素的顯著性比較結(jié)果見(jiàn)表3、4。

表4 水解度回歸模型方差分析表Table4 Variance analysis of regression equation

利用SAS軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，對(duì)各因素回歸擬合后，得到回歸方程為：

圖5 酶添加量與溫度對(duì)鮐魚(yú)頭水解度的影響Fig.5 Response surface showing the effect of enzyme dosage and temperature on the DH of P. japonicns heads

圖6 酶添加量與時(shí)間對(duì)鮐魚(yú)頭水解度的影響Fig.6 Response surface showing the effect of enzyme dosage and time on the DH of P. japonicns heads

用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，其因素和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著(R2= 0.9817)，模型達(dá)極顯著水平(P＜0.01)，而失擬項(xiàng)F值不顯著，說(shuō)明方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合較好，因此用此方程模型來(lái)模擬3因素與指標(biāo)值的關(guān)系是可行的。影響水解效果的3個(gè)因素加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間的顯著水平均小于0.01，影響效果極顯著。

圖7 溫度與時(shí)間對(duì)鮐魚(yú)頭水解度的影響Fig.7 Response surface showing the effect of temperature and time on the DH of P. japonicns heads

回歸方程的特征值存在異號(hào)，因此在回歸方程所對(duì)應(yīng)的拋物線不存在最大值，需進(jìn)行嶺分析。將酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間3個(gè)參數(shù)分別固定，水解度隨其余兩個(gè)參數(shù)變化的趨勢(shì)如圖5～7所示。由圖5～7可知：隨著酶添加量與酶解時(shí)間的增加，酶解液的水解度不斷提高，但都趨于平緩；隨著酶解溫度的升高，水解度先升高后下降。經(jīng)響應(yīng)面嶺分析得出3個(gè)影響因素的最佳組合為酶添加量1311U/g、溫度46℃、反應(yīng)時(shí)間7h，此時(shí)的水解度達(dá)到31.31%。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在最佳酶解條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得的水解度為31.18%，可見(jiàn)該模型能較好的預(yù)測(cè)鮐魚(yú)頭的酶解情況。

在上述最佳條件下，得到的鮐魚(yú)頭酶解液水解度在31%左右。陳奕華等[17]利用酶法水解鯪魚(yú)頭，最佳條件下鯪魚(yú)頭的酶解度為30.5%；陳海桂等[18]采用酶水解鮐魚(yú)蛋白制取功能性魚(yú)蛋白粉，得到水解度為32.4%的鮐魚(yú)酶解液；章葉江等[19]雙酶水解鰹魚(yú)頭，最佳工藝條件下得到的水解度為23.4%，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前二者接近，但高于章葉江等得到的鰹魚(yú)頭水解度。

3 結(jié) 論

選擇中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對(duì)鮐魚(yú)頭進(jìn)行酶解，比較其水解度，最終選擇風(fēng)味蛋白酶，并采用響應(yīng)面法對(duì)風(fēng)味蛋白酶酶解鮐魚(yú)頭的3個(gè)主要因素酶添加量、溫度、時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，酶添加量1311U/g、溫度46℃、反應(yīng)時(shí)間7h，水解度達(dá)

到最高31.18%，所得的酶解液可噴霧干燥加工成水產(chǎn)動(dòng)物蛋白粉，經(jīng)調(diào)味后有望制成特殊風(fēng)味的調(diào)味品或經(jīng)調(diào)配制備多肽飲料等，使鮐魚(yú)頭變廢為寶。

[1]鮑建民. 鮐魚(yú)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及組胺中毒的預(yù)防[J]. 中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng), 2006(3): 55.

[2]SAFARI R, MOTAMEDZADEGAN A, OVISSIPOUR M. Use of hydrolysates from yellowfin tuna (Thunnus albacares) heads as a complex nitrogen source for lactic acid bacteria[J]. Food Bioprocess Technol, DOI 10.1007/s11947-009-0225-8.

[3]華景薇. 功能食品新原料: 低分子質(zhì)量肽[J]. 浙江食品工業(yè), 1993, 5 (1): 1-5.

[4]JE J Y, LEE K H, LEE M H, et al. Antioxidant and antihypertensive protein hydrolysates produced from tuna liver by enzymatic hydrolysis [J].Food Res Int, 2009, 42(9): 1266-1272.

[5]JUN S Y, PARK P J, JUNG W K, et al. Purification and characterization of an antioxidative peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein[J]. Eur Food Res Technol, 2004, 219 (1): 20-26.

[6]楊萍, 蔡本利, 洪鵬志, 等. 黃鰭金槍魚(yú)頭蛋白酶解液及其分級(jí)組分對(duì)小鼠免疫功能的影響[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2009, 28(1): 131-135.

[7]王浩田, 張建榮, 馬儷珍, 等. 鯰魚(yú)骨蛋白酶解產(chǎn)物與其他防腐劑抑菌效果的比較[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工: 學(xué)刊, 2009(4): 89-92.

[8]GUERARD F, GUIMAS L, BINET A. Production of tuna waste hydrolysates by a commercial neutral protease preparation[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2002, 19/20: 489-498.

[9]BOUGATEF A , NEDJAR-ARROUME N, MANNI L, et al. Purification and identification of novel antioxidant peptides from enzymatic hydrolysates of sardinelle (Sardinella aurita) by-products proteins[J]. Food Chemistry, 2010, 118(3): 559-565.

[10]GB/T 5009.5—2003 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2003.

[11]大連輕工業(yè)學(xué)院. 食品分析[M]. 北京: 中國(guó)輕工業(yè)出版社, 2002: 148-150.

[12]王秀奇, 秦淑媛, 高天慧, 等. 基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 2版. 北京: 高等教育出版社, 1996: 177-180.

[13]洪鵬志, 楊萍, 曾少葵, 等. 黃鰭金槍魚(yú)頭蛋白酶解條件的研究[J].食品科技, 2007(3): 100-103.

[14]侯溫甫, 陳成, 劉良忠. 影響淡水魚(yú)頭酶解的因素研究[J]. 福建水產(chǎn), 2008(2): 47-50.

[15]周濤, 林建利, 李新勇, 等. 酶解鮐魚(yú)廢棄物制取魚(yú)蛋白質(zhì)水解物的研究[J]. 浙江水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào), 1998, 17(2): 102-108.

[16]段振華, 張慜, 郝建. 酶法水解鳙魚(yú)下腳料及其降苦機(jī)理研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2003, 24(5): 19-22.

[17]陳奕華, 肖斌. 綜合利用鯪魚(yú)加工下腳料魚(yú)頭的工藝探討[J]. 廣州食品工業(yè)科技, 1999, 15(1): 8-12.

[18]陳海桂, 王陽(yáng)光. 酶解鮐魚(yú)蛋白制取功能性魚(yú)蛋白粉加工工藝研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2008(20): 227-228.

[19]章葉江, 范宗澤, 楊萍, 等. 雙酶法水解鰹魚(yú)頭的工藝條件探討[J].食品科技, 2005(1): 40-42.

Enzymolysis of Pneumatophorus japonicns Heads by Using Response Surface Analysis

FU Chun-yan，ZHOU Dan-jun，LU Yan，LIU Bing-bing，YANG Wen-ge*
(Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

The effects of neutral, papain and flavor protease on the degree of hydrolysis of Pneumatophorus japonicns heads were studied, then the enzymolysis conditions of flavor protease were optimized by using response surface method (RSM). The results showed that flavor protease has the best enzymolysis effect. The effect of enzyme dosage, enzymolysis temperature and time on the degree of hydrolysis (DH) were significant. By the RSM transactional analysis, the optimum enzymolysis conditions were optimized as following: enzyme dosage 1311 U/g, enzymolysis temperature 46 ℃ and time 7 h, respectively. The DH was up to 31.18% under the optimum condition.

response surface method；Pneumatophorus japonicns heads；enzymolysis；degree of hydrolysis

S965.327

A

1002-6630(2010)22-0054-05

2010-01-13

浙江省教育廳學(xué)科帶頭人培養(yǎng)專(zhuān)項(xiàng)(2008932)；寧波大學(xué)博士基金項(xiàng)目(BSL2008003)

傅春燕(1985—)，女，碩士研究生，研究方向水產(chǎn)品加工與高值化利用。E-mail：fuchunyan1017@126.com

*通信作者：楊文鴿(1966—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品保鮮加工與高值化利用。E-mail：yangwenge@nbu.edu.cn