曹 亮，周建軍*，魏 銳，劉益紅

(陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001)

虎杖中白藜蘆醇發(fā)酵和提取工藝

曹 亮，周建軍*，魏 銳，劉益紅

(陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001)

目的：對虎杖中白藜蘆醇的發(fā)酵和提取工藝進(jìn)行研究。方法：以漢中地區(qū)的虎杖為原料，通過正交試驗(yàn)研究虎杖中白藜蘆醇自然發(fā)酵和提取條件。結(jié)果：最佳發(fā)酵條件為溫度45℃、料液比1:3、發(fā)酵時(shí)間48h、白藜蘆醇苷的轉(zhuǎn)化率為96.1%；自然發(fā)酵后最佳提取條件為98%甲醇、料液比1:6、提取3次、每次1h，白藜蘆醇的得率達(dá)1.912%；通過發(fā)酵和提取，虎杖中白藜蘆醇的提取率達(dá)90%。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)可為虎杖中白藜蘆醇的發(fā)酵和提取提供一定參考。

虎杖；白藜蘆醇；白藜蘆醇苷；發(fā)酵

虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et.Zucc)為蓼科多年生灌木狀草本植物，主要分布于我國長江以南各地和陜西、湖北及四川等地?；⒄群喾N有效成分，主要包括蒽醌和芪類化合物，其中芪類化合物中的白藜蘆醇具有重要生物活性[1-3]。

白藜蘆醇(Res)化學(xué)名3,4,5-三羥基-二苯乙烯，分子式C14H12O3，熔點(diǎn)256～257℃。易溶于極性溶劑如甲醇、乙醇、乙酸乙酯等[4-5]。在植物體內(nèi)主要以白藜蘆醇苷(PDT)形式存在。

目前，虎杖中白藜蘆醇提取方法主要有兩類，一類是先提取白藜蘆醇苷，然后再利用專一性酶[6-7]將白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，但在提取純化苷的過程中，原有的部分白藜蘆醇會(huì)丟失；另外一類方法是采用專一性酶[8]或是篩選專一性微生物[9]先將虎杖發(fā)酵使白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，然后再提取純化，雖然避免了虎杖中原有白藜蘆醇的損失，但操作繁瑣，成本較高。也有報(bào)道[10]利用虎杖中微生物產(chǎn)生的酶進(jìn)行發(fā)酵，但對于發(fā)酵后的提取工藝報(bào)道各異。本實(shí)驗(yàn)先將虎杖進(jìn)行自然發(fā)酵，然后重點(diǎn)對提取工藝進(jìn)行研究，通過優(yōu)化發(fā)酵條件及提取工藝，為白藜蘆醇工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

虎杖(經(jīng)陜西理工學(xué)院趙樺教授鑒定)產(chǎn)自秦嶺南坡中段漢中市留壩縣生產(chǎn)基地，先將虎杖切片，40℃干燥至質(zhì)量恒定，用中藥粉碎機(jī)粉碎成細(xì)粉備用。經(jīng)索氏提取，HPLC測定，虎杖中白藜蘆醇苷的含量3.70%，白藜蘆醇含量0.27%。

甲醇(分析純)、乙腈(色譜純)；超純水 自制；白藜蘆醇苷對照品、白藜蘆醇對照品 中國生物制品研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀 美國Waters公司；302型電熱鼓風(fēng)干燥箱 山東濰坊醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司醫(yī)療器械廠；FW-177型中藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；AB204型電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；恒溫氣候箱、SHH421-420型恒溫水浴鍋 河北航天儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 檢測方法

1.3.1.1 液相色譜條件

參考周建軍等[11-12]的檢測方法：色譜柱Symmertry-C18(3.9mm×150mm)，流動(dòng)相乙腈-水(19.5:80.5)，流速1.0mL/min，柱溫28℃，檢測波長303nm，進(jìn)樣量10μL，保留時(shí)間14min。

1.3.1.2 對照品溶液的制備

精確稱量白藜蘆醇苷4.0mg和白藜蘆醇3.0mg，分別置于100mL容量瓶中，加適量甲醇，超聲溶解，再定容至刻度，搖勻，作為對照品儲(chǔ)備液(白藜蘆醇苷質(zhì)量濃度為40μg/mL，白藜蘆醇質(zhì)量濃度為30μg/mL)。

將儲(chǔ)備液配成5個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合液作為對照品溶液：1)白藜蘆醇苷質(zhì)量濃度為4.00μg/mL，白藜蘆醇質(zhì)量濃度為27.00μg/mL的對照品溶液；2)白藜蘆醇苷質(zhì)量濃度為8.00μg/mL，白藜蘆醇質(zhì)量濃度為21.00μg/mL的對照品溶液；3)白藜蘆醇苷質(zhì)量濃度為12.0μg/mL，白藜蘆醇質(zhì)量濃度為15.00μg/mL的對照品溶液；4)白藜蘆醇苷質(zhì)量濃度為16.00μg/mL，白藜蘆醇質(zhì)量濃度為9.00μg/mL的對照品溶液；5)白藜蘆醇苷質(zhì)量濃度為20.00μg/mL，白藜蘆醇質(zhì)量濃度為3.00μg/mL的對照品溶液。

1.3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將5個(gè)不同質(zhì)量濃度的白藜蘆醇苷和白藜蘆醇對照品混合液依次分別進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、以質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，用直線回歸方程的方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，白藜蘆醇苷的直線方程為：Y=34983X+3570(r2=0.99991)，其質(zhì)量濃度在4.00～20.00 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；白藜蘆醇的直線方程為：Y=57938X+19801(r2=0.99994)，其質(zhì)量濃度在3.00～27.00μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

1.3.1.4 供試品溶液的制備

精確稱取虎杖粉末10.00g，按照一定的料液比加水，在恒溫培養(yǎng)箱中按照設(shè)定的溫度發(fā)酵，然后將發(fā)酵物按比例加入溶劑，回流提取3次，合并3次濾液，精確吸取濾液1mL，用甲醇定容到10mL，用0.45μm樣品過濾器過濾，待測。

1.3.1.5 含量測定

樣品溶液在與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的色譜條件下進(jìn)樣，重復(fù)3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中白藜蘆醇苷及白藜蘆醇的含量，樣品色譜圖見圖1。

圖1 樣品液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of the sample

1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2.1 發(fā)酵條件的選擇

根據(jù)瞿衛(wèi)林[13]的報(bào)道和曹庸[14]的專利，選擇發(fā)酵時(shí)間、溫度、料液比為考察因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)進(jìn)行發(fā)酵條件的選擇，并根據(jù)最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。因素水平見表1。

表1 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)因素水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing fermentation conditions

1.3.2.2 提取條件的選擇

按最佳發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵后，選擇甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取次數(shù)和提取時(shí)間作為考察因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)，選擇最佳提取條件，并根據(jù)最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。因素水平見表2。

表2 提取條件正交試驗(yàn)因素水平Table2 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing extraction conditions

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)

發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析見表3、4。

表3 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table3 Design and results orthogonal experiments for optimizing fermentation conditions

從發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果和極差分析看出，各因素的影響順序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間＞溫度＞料液比，通過對白藜蘆醇發(fā)酵條件的選擇以及經(jīng)濟(jì)效益的綜合考慮，可以得出白藜蘆醇發(fā)酵的最佳條件：料液比1:3、溫度45℃、發(fā)酵時(shí)間48h。

表4 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table4 Variance analysis of orthogonal experiments for optimizing fermentation conditions

方差分析表明：發(fā)酵時(shí)間對白藜蘆醇含量的影響極顯著(F＞F(0.01))，發(fā)酵溫度對白藜蘆醇含量的影響顯著(F(0.01)＞F＞F(0.05))，而料液影響不顯著(F＜F(0.05))。

2.2 發(fā)酵條件驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)發(fā)酵正交試驗(yàn)最佳工藝，進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)(n=3)，結(jié)果見表5。

表5 發(fā)酵條件驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table5 Results of confirmatory experiments for optimizing fermentation conditions

表5結(jié)果表明，經(jīng)過發(fā)酵白藜蘆醇苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)96.1%[(3.683－0.143)/3.683]，表明虎杖中絕大部分白藜蘆醇苷已轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇。

2.3 提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果

提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析見表6、7。

表6 提取條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table6 Design and results orthogonal experiment for optimizing extraction conditions

表7 提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table7 Variance analysis of orthogonal experiments for optimizing extraction conditions

從提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果和極差分析看出，各因素的影響順序?yàn)榧状俭w積分?jǐn)?shù)＞提取次數(shù)＞料液比＞提取時(shí)間，得出虎杖發(fā)酵后白藜蘆醇的最佳提取條件：98%甲醇、料液比1:6、提取3次、每次1 h。

方差分析表明，甲醇體積分?jǐn)?shù)對發(fā)酵后提取影響極顯著(F＞F(0.01))，提取次數(shù)和料液比影響顯著(F(0.01)＞F＞F(0.05))，而提取時(shí)間影響不顯著(F＜F(0.05))。

2.4 提取條件驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)提取正交試驗(yàn)確定的最佳工藝，精確稱取虎杖粉末10.00g，進(jìn)行3次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表8。

表8 提取條件驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table8 Results of confirmatory experiments for optimizing extraction conditions

表8表明，虎杖發(fā)酵后白藜蘆醇提取的平均得率1.912%，RSD值0.53%。說明本實(shí)驗(yàn)?zāi)軐⒋蟛糠职邹继J醇提取出來，并且結(jié)果穩(wěn)定。

3 討論與結(jié)論

采用干虎杖加水自然發(fā)酵，不需要專一性的酶和培養(yǎng)專一性的微生物，降低了成本、簡化了工藝。通過正交試驗(yàn)得出白藜蘆醇的最佳發(fā)酵條件：溫度45℃、料液比1:3、發(fā)酵時(shí)間48h；白藜蘆醇苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)96.1%，這與瞿衛(wèi)林[13]等的報(bào)道基本一致。

通過正交試驗(yàn)得出白藜蘆醇的最佳提取條件：98%甲醇、料液比1:6、提取3次、每次1h。虎杖中白藜蘆醇的得率為1.912%，提取率達(dá)90%，結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于向海艷[15]和董學(xué)偉[6]等的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為白藜蘆醇的工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考依據(jù)。

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Fermentation and Extraction of Resveratrol from Polygonum cuspidatum

CAO Liang，ZHOU Jian-jun*，WEI Rui，LIU Yi-hong
(School of Bioscience and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723001, China)

Objective: To explore the fermentation and extraction processing of resveratrol from Polygonum cuspidatum. Methods: Polygonum cuspidatum from Hanzhong area was used as the material to explore the optimal fermentation and extraction conditions of resveratrol by orthogonal experiments. Results: The optimal conditions for fermentation were fermentation temperature of 45 ℃, material-liquid ratio of 1:3, and fermentation time of 48 h. The conversion rate of polydatin was 96.1% under the optimal fermentation conditions. The optimal conditions for the extraction of resveratrol were 98% methanol as solvent, solid-liquid ratio of 1:6, extraction time of 1 h, and extraction repeat number of 3. The yield of resveratrol was 1.912% under the optimal extraction conditions. The extraction rate of resveratrol could reach up to 90% through optimal fermentation and extraction. Conclusion: These studies provide a theoretical reference for the fermentation and extraction of resveratrol from Polygonum cuspidatum.

Polygonum cuspidatum Sieb.et.Zucc；resveratrol；polydatin；fermentation

TQ214

A

1002-6630(2010)22-0207-04

2010-06-23

曹亮(1984—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参镔Y源開發(fā)與利用。E-mail：phas0614@tom.com

*通信作者：周建軍(1953—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)樯镔Y源開發(fā)利用。E-mail：jjzhou01@163.com