張 然，王 晶*，朱春花，朱振華

(1.常熟理工學(xué)院生物食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130000)

超聲波提取蘇芡黃酮類化合物工藝

張 然1，王 晶2,*，朱春花1，朱振華1

(1.常熟理工學(xué)院生物食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130000)

以蘇芡為原料采用超聲波法提取蘇芡中黃酮類化合物，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化得出超聲波提取黃酮類化合物的最佳工藝條件。結(jié)果顯示，在各影響因素中，影響程度：超聲波功率＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞提取時間。在超聲功率200W、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取溫度40℃、浸提60min的條件下芡實(shí)黃酮類化合物得率最高，可達(dá)0.146mg/g。

蘇芡；黃酮；超聲波提取

芡實(shí)(Eu ry ale fe ro x)別名雞頭米，為睡蓮科(Nymphaeaceae)芡屬植物芡(Euryale ferox Salisb)的成熟種仁[1]，在江蘇、安徽等地均有出產(chǎn)，蘇芡為蘇州產(chǎn)芡實(shí)，因口味更佳而馳名國內(nèi)外。芡實(shí)味甘、澀、平，有健脾止瀉、益腎固精、祛濕止帶、延緩衰老之功能[2-3]?，F(xiàn)代研究表明，芡實(shí)含有大量對人體有益的營養(yǎng)素，如含有大量蛋白質(zhì)、碳水化合物、無機(jī)鹽等[4]。黃酮類化合物有十多個類別，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)約4000余種[5]。黃酮類化合物有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、利膽、強(qiáng)心鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛等作用[6]。國內(nèi)外的研究表明，黃酮類化合物不僅具有多種生物學(xué)活性，而且具有劑量小、見效快、毒性低等優(yōu)點(diǎn)，所以在食品和醫(yī)藥保健領(lǐng)域的開發(fā)利用方面有著十分廣闊的前景。本實(shí)驗(yàn)探討超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、浸提時間4個因素對蘇芡中總黃酮得率的影響，以獲取提取蘇芡中黃酮類物質(zhì)的最佳工藝參數(shù)，為蘇芡實(shí)的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘇芡購自蘇州同里芡實(shí)生產(chǎn)基地，經(jīng)常熟理工學(xué)院生物系郝建華副教授鑒定為紫花蘇芡。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

TG16-WS臺式高速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；電熱恒溫干燥箱 上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KQ-250GTDV型高頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；752紫外-可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃酮的提取

1.3.1.1 原料預(yù)處理

將芡實(shí)洗凈、以蒸餾水浸泡12h，60℃烘箱烘干，研磨粉碎、40目過篩后備用。

1.3.1.2 超聲波提取

準(zhǔn)確稱取處理好的芡實(shí)粉末，放入碘量瓶，按1:10料液比(g/mL)加入一定體積分?jǐn)?shù)乙醇，選擇一定溫度在一定的超聲波功率下空化一定時間，取出碘量瓶，離心后過濾，收集濾液。

1.3.2 單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)

首先擬定超聲波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定L9(34)正交試驗(yàn)工藝參數(shù)范圍，通過正交試驗(yàn)尋找最佳提取工藝條件。

1.3.3 總黃酮的測定

1.3.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液配制

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品10.00mg，用95%乙醇溶解定容至100mL，搖勻，即得每1mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液中含無水蘆丁0.10mg。

1.3.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、4.5mL，分別置于盛有30%乙醇溶液的10mL試管中，用30%乙醇補(bǔ)充至5mL再各加入5% NaNO2溶液0.3mL，混勻，放置6min。然后分別加入0.3mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻，放置6min。再分別加入4% NaOH溶液2mL，搖勻，顏色加深，最后用30%乙醇稀釋至刻度，放置15～20min后在該物質(zhì)的最大吸收峰λ=510nm處測吸光度，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量深度(Y)為橫坐標(biāo)建立直線回歸，得線性回歸方程：Y/(mg/mL) =0.08245A+ 0.0233，R= 0.9996。

分別精密吸取不同提取條件下所得濾液1mL，按上述操作，于510nm處測吸光度值參照線性回歸方程計(jì)算含量。

1.3.4 精密度實(shí)驗(yàn)

精密移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1mL，共5份，分別置于10mL試管中，按1.3.3.2節(jié)操作，計(jì)算吸光度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取正交試驗(yàn)最佳工藝條件下所得濾液為供試品溶液，按1.3.3.2節(jié)操作，分別在0、15、30、45、60min測定其吸光度。計(jì)算吸光度的RSD。

1.3.6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

分別精密量取同一批供試品溶液5份，按1.3.3.2節(jié)操作，獨(dú)立測定各份供試品溶液的吸光度并計(jì)算總黃酮含量，計(jì)算吸光度的RSD。

1.3.7 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

精密量取供試品溶液5份，分別加入蘆丁對照品適量，按1.3.3.2節(jié)操作，分別測定總黃酮含量，計(jì)算平均回收率及RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波功率對芡實(shí)黃酮類化合物得率的影響

精確稱取2.00g芡實(shí)粉末，以70%乙醇溶液為溶劑，在溫度40℃、提取時間30min、料液比1:10(g/mL)條件下，測定125、150、175、200、225、250W超聲波功率下芡實(shí)中黃酮得率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 超聲波功率對蘇芡黃酮類化合物得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on extraction rate of flavonoids from Euryale ferox planted in Suzhou

由圖1可知，其他條件不變，芡實(shí)中黃酮類化合物得率隨著超聲波功率的增加而提高，當(dāng)超聲波功率為200W時，黃酮類化合物得率達(dá)最高值，而后隨功率的增加呈現(xiàn)降低的趨勢，這是由于超聲波對植物細(xì)胞的破碎作用，加速有效成分的溶解，但是當(dāng)隨著超聲波的功率不斷增大，對細(xì)胞的破碎作用相應(yīng)增大，溶解雜質(zhì)也增加，有效成分溶解量減少[7]，且超聲波功率越大產(chǎn)生的熱量越多，會破壞某些黃酮類化合物，故得率不僅沒有明顯提高反而呈下降趨勢。

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對芡實(shí)黃酮類化合物得率的影響

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對蘇芡黃酮類化合物得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of flavonoids from Euryale ferox planted in Suzhou

準(zhǔn)確稱取2.00g芡實(shí)粉末，在料液比1:10、溫度40℃、200W超聲波功率條件下提取30min，測定70%、75%、80%、85%、90%、95%乙醇體積分?jǐn)?shù)下的芡實(shí)黃酮得率，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高芡實(shí)黃酮的得率有上升趨勢，在75%～80%間達(dá)到最大值，隨后得率下降，這可能是因?yàn)殡S著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，溶于乙醇中的黃酮類化合物溶出量增加，得率隨之提高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加到一定條件時，部分水溶性黃酮類化合物溶出量降低，且乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，會導(dǎo)致芡實(shí)中的脂溶性成分被同時提取出來，從而導(dǎo)致測定值偏低，使得黃酮類化合物的得率降低[8]。

2.3 溫度對芡實(shí)黃酮類化合物得率的影響

準(zhǔn)確稱取2.00g芡實(shí)粉末，以80%乙醇溶液作為溶劑，在料液比1:10、200W超聲波提取30min測定20、25、30、35、40、45、50℃時的芡實(shí)黃酮得率，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，芡實(shí)黃酮類化合物得率在35℃時最大，隨后得率呈下降趨勢，可能是由于高溫易破壞黃酮類化合物所致[9]。

2.4 提取時間對芡實(shí)黃酮類化合物得率的影響

圖4 提取時間對蘇芡黃酮類化合物得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of flavonoids from Euryale ferox planted in Suzhou

準(zhǔn)確稱取2.00g芡實(shí)粉末，以80%乙醇作為溶劑，在料液比1:10、溫度35℃、超聲波功率200W條件下，測定20、40、60、80、100、120min時芡實(shí)中黃酮的得率，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，提取時間在40～60min之間，提取效果最好，時間延長，得率反而降低，這可能是提取時間過長，有部分乙醇揮發(fā)[10]，且長時間的超聲波處理可能會影響黃酮類化合物的穩(wěn)定性，從而影響提取效果引起得率下降。

2.5 正交試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)表明，超聲波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時間這幾個因素對芡實(shí)中黃酮類化合物的提取均有影響，在實(shí)際操作中各因素之間會相互交叉影響，因此在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)L9(34)以進(jìn)一步研究多因素對提取效果的影響，試驗(yàn)因素水平選擇見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見表2。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal experiments

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Results and range analysis of orthogonal experiments

從表2的直觀分析結(jié)果表明，最佳的提取工藝條件：超聲波功率200W、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取溫度40℃、浸提時間60min，即A2B2C3D2。由極差值可知，超聲波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間4因素對芡實(shí)黃酮類化合物得率影響的主次順序：超聲波功率＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞提取時間。

精密度實(shí)驗(yàn)測得平均吸光度為0.1322，RSD為0.63%，說明精密度良好；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的RSD為0.45%，表明供試品溶液在60min內(nèi)保持穩(wěn)定；重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果的RSD為1.54%，表明重現(xiàn)性良好；加樣回收率實(shí)驗(yàn)所得的平均回收率為90.12%，RSD為1.24%，說明回收率高，準(zhǔn)確度好。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在最佳條件下，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)所得芡實(shí)中黃酮類化合物的得率分別為0.144、0.144、0.149mg/g，3次實(shí)驗(yàn)得率的平均值為0.146mg/g，高于正交試驗(yàn)各組得率。

3 討論與結(jié)論

通過單因素及正交試驗(yàn)獲得了超聲波提取芡實(shí)中黃酮的最佳工藝條件：超聲波功率200W、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、超聲波作用溫度40℃、作用時間60min。在此最佳條件下，超聲波提取芡實(shí)中黃酮類化合物的得率為0.146mg/g，明顯高于其他條件下的得率。NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系與黃酮形成絡(luò)合物的分光光度分析法線性關(guān)系好，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性好，回收率較高。

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Ultrasonic Extraction of Flavonoids from Euryale ferox Planted in Suzhou

ZHANG Ran1，WANG Jing2,*，ZHU Chun-hua1，ZHU Zhen-hua1
(1. Department of Biotechnology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China；2. Department of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130000, China)

Euryale ferox planted in Suzhou was used as the raw material to extract flavonoids by ultrasonic extraction. The optimal extraction processing conditions for flavonoids from Euryale ferox were explored by orthogonal experiments. Results indicated that the impacts of factors on extraction rate from strong to weak were ultrasonic power, ethanol concentration, extraction temperature and extraction time. The optimal extraction processing parameters were ultrasonic power of 200 W, 80% ethanol as extraction solvent, extraction temperature of 40 ℃ and extraction time of 60 min. The extraction rate of flavonoids was 0.146 mg/g under the optimal extraction conditions.

Euryale ferox planted in Suzhou；flavonoids；ultrasonic extraction

TQ244.2

A

1002-6630(2010)22-0247-04

2010-06-22

蘇州市科技局項(xiàng)目(SN201035；KY2009051)

張然(1973—)，女，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)及功效成分。E-mail：rany@cslg.edu.cn

*通信作者：王晶(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊皇称饭πС煞旨凹庸すに?。E-mail：wangjing08042201@163.com