田國政，何義發(fā)

(湖北民族學院生物科學與技術學院，湖北 恩施 445000)

薇菜葉總黃酮提取工藝條件優(yōu)化

田國政，何義發(fā)

(湖北民族學院生物科學與技術學院，湖北 恩施 445000)

以薇菜葉為原料進行總黃酮提取條件的優(yōu)化?？疾煲掖俭w積分數、浸取時間、料液比、溫度4個因素對薇菜中總黃酮類化合物提取率的影響，并設計L9(34)正交試驗進行提取工藝優(yōu)化研究。結果表明：提取薇菜中總黃酮類化合物的最佳工藝：乙醇體積分數60%、提取時間1.5h、料液比1:25(g/mL)、浸提溫度70℃，總黃酮類化合物提取得率可達1.29%。本研究方法成本低，提取得率高，可為設計提取薇菜葉總黃酮中試參數提供參考。

薇菜；總黃酮；提??；工藝優(yōu)化

黃酮類化合物幾乎存在于所有的綠色植物體中[1]，其主體分子結構式具有15個碳原子的多元酚化合物，具有C6-C3-C6基本構型[2]。近年來研究表明，從植物體分離出來的黃酮類化合物具有抗腫瘤[3-4]、抗衰老[5]、清除OH-[6]、鎮(zhèn)痛[7]、免疫調節(jié)[8]、防治心腦血管疾病[9]、降血糖[10-11]等多種藥理作用。關于黃酮的提取方法[12]、提取條件[13]以及工藝優(yōu)化等方面的研究較多，技術比較成熟，應用廣，但不同材料黃酮提取條件的差異性還是存在的。薇菜中含有一定量的黃酮類化合物，充分利用薇菜資源，提取分離其中的黃酮類化合物，對開發(fā)薇菜保健食品具有重要的作用。本實驗主要研究薇菜葉總黃酮類化合物的提取分離工藝，并對其進行優(yōu)化，為薇菜的開發(fā)利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

薇菜由湖北民族學院生物科學與技術學院何義發(fā)教授提供，2008年6月27日采于湖北民族學院薇菜基地，采后切成1cm長，90℃烘干，將干燥的薇菜葉用粉碎機粉碎過60目篩，貯于磨口瓶中備用。

蘆丁(標準品)、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇，其他試劑均為A R級。

UV-2550型分光光度計 日本島津公司；旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；水浴鍋 上海錦屏有限責任公司；CR-21G型離心機 日本Hitachi公司；烘箱 湖北黃石醫(yī)療器械廠；超聲波清洗機 寧波生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 薇菜葉總黃酮的提取與含量測定

1.2.1.1 標準曲線的準備

精確稱取5.0000mg蘆丁標準品，置于燒杯中，加適量70%乙醇充分溶解，倒入100mL容量瓶中定容。精密吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL蘆丁分別置于10mL刻度試管中，各加超純水至5mL，加5% NaNO2試液0.3mL，搖勻，靜止放置6min；加10%的Al(NO3)3試液0.3mL，搖勻，靜止放置6min；加4% NaOH試

液2.0mL，加超純水至刻度，搖勻，靜止15min。以0mL蘆丁作空白，在510nm波長處測吸光度，以標準蘆丁的量與吸光度計算回歸方程，y=0.068971429x+ 0.001571(R=0.999787)。

1.2.1.2 薇菜葉總黃酮的提取與含量測定

薇菜葉總黃酮的提?。壕_稱量5g薇菜葉樣品于燒瓶中，石油醚浸泡去色，重復3次，過濾，將濾渣放在80℃的干燥箱中揮發(fā)去掉石油醚。去色的樣品采用不同的乙醇體積分數、料液比、時間、溫度等因素處理后，用超純水分別定容至200mL，離心得到上清液，取上清液4mL定容至10mL，再取0.2mL溶液至刻度試管中，加超純水至5mL，用超純水作空白對照。

總黃酮含量測定方法：按文獻[14]的方法進行。通過總黃酮提取率公式計算薇菜葉中總黃酮提取率。

式中：X為根據標準曲線計算出的總黃酮含量/μg；V為樣液定容總體積/mL；V0為測定吸光度用樣液的體積/mL ；V1為總體積中吸取樣液的體積/mL；m為薇菜葉樣品質量/g。

1.2.2 薇菜葉總黃酮提取的單因素試驗

分別進行乙醇體積分數、溫度、浸提時間、料液比4個單因素試驗，考察各因素對總黃酮提取率的影響。

1.2.3 薇菜葉總黃酮提取的工藝條件優(yōu)化

根據單因素試驗結果，以不同乙醇體積分數、提取時間、料液比、提取溫度為考察因素，薇菜葉總黃酮提取率為指標，進行L9(34)正交試驗[15]，因素水平如表1所示。

表1 正交試驗因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal experiments

2 結果與分析

2.1 乙醇體積分數對薇菜葉總黃酮提取率的影響

在提取時間2h、料液比1:20、提取溫度60℃條件下，采用不同乙醇體積分數提取薇菜葉總黃酮，結果見圖1。乙醇體積分數為30%時薇菜葉總黃酮乙醇提取率僅1.04%，體積分數增加到50%時可達1.22%，之后隨著乙醇體積分數的增加，提取率變化不大。

圖1 乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響Fig. 1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids from Osmunda japonica

2.2 提取時間對薇菜葉總黃酮提取率的影響

圖2 浸提時間對提取率的影響Fig.2 Effect of soaking time on extraction rate of total flavonoids from Osmunda japonica

在料液比1:20、提取溫度60℃、乙醇體積分數60%，測定提取時間對薇菜葉總黃酮提取率的影響，結果見圖2。不同浸提時間對薇菜葉總黃酮的提取率有一定的影響，浸提2h的效果相對較好，提取率達1.05%，隨著提取時間的延長，總黃酮的含量慢慢減少。

2.3 料液比對薇菜葉總黃酮提取率的影響

圖3 料液比對提取率的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids from Osmunda japonica

在提取溫度60℃、乙醇體積分數60%、提取時間2h測定料液比對薇菜葉總黃酮提取率的影響，結果見圖3。料液比對薇菜葉總黃酮的提取率有一定的影響，料液比在1:10至1:30之間，薇菜葉總黃酮的提取率隨著料液比的增加而增加，料液比1:30時，薇菜葉總黃酮的提取率比料液比1:10高出38.47%，比料液比1:20高24.45%，

料液比1:30、1:40時薇菜葉總黃酮的提取率變化較小。

2.4 提取溫度對薇菜葉總黃酮提取率的影響

圖4 溫度對提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of total flavonoids from Osmunda japonica

在乙醇體積分數60%，提取時間2h，料液比1:20測定提取溫度對薇菜葉總黃酮提取率的影響，結果見圖4。從50℃開始對薇菜葉總黃酮提取率隨著溫度的升高而增加，當溫度達80℃時，薇菜葉總黃酮提取率最大，達到了1.273%，以后隨著溫度的升高薇菜葉總黃酮提取率變化不明顯，保持在1.14%～1.27%的水平。

2.5 正交試驗結果

采用L9(34)正交表搭配處理組合，重復3次試驗，求其平均值，結果采用單向分組資料分析方法進行極差和方差分析。

表2 薇菜葉總黃酮提取L9(34)正交組合試驗設計及結果Table2 Design and results of orthogonal experiments for optimizing extraction conditions of total flavonoids from Osmunda japonica

由表2極差可見，各因素對薇菜葉總黃酮提取率的影響從大到小依次為RA＞RD＞RB＞RC，即乙醇體積分數＞提取溫度＞提取時間＞提取料液比，但提取溫度、提取時間、提取料液比組內的極差值很小，確定最佳工藝條件為A3B1C1D1，即乙醇體積分數60%、提取時間1.5h、料液比1:25(g/mL)、提取溫度70℃。

表3 正交試驗方差分析表Table3 Variance analysis of orthogonal experiments

由表3可得，FA＞F0.05(2,2)，A因素達到了顯著性差異，說明乙醇體積分數對薇菜葉總黃酮提取率影響最大，B、C、D因素影響較小。A因素中A3＞A2＞A1，乙醇體積分數以A3最優(yōu)。故薇菜葉總黃酮提取工藝條件組合為A3B1C1D1，即乙醇體積分數60%、提取時間為1.5h、料液比1:25、提取溫度70℃。

3 結 論

本研究探索了乙醇體積分數、提取時間、料液比、提取溫度4個單因素對薇菜葉總黃酮提取率的影響，進行了L9(34)正交試驗。通過極差和方差分析得到結果：對薇菜葉總黃酮提取率影響因素最大的是乙醇體積分數，達到了顯著性差異，其他3個因素影響較小。其原因主要是黃酮類化合物溶于有機溶劑，同時在分子中引入－OH會使其極性增大，在極性溶劑中的溶解度也相應增大，因此在提供一定體積分數的乙醇體積分數時，讓薇菜葉樣品充分吸收水分，在乙醇的作用下溶解以達到提取的最大效率。綜合分析提取薇菜葉總黃酮的工藝條件組合為乙醇體積分數為60%、提取時間為1.5h、料液比1:25、提取溫度為70℃，總黃酮類化合物提取得率可達1.29%。此法操作簡單，成本低，用時短，穩(wěn)定性好，利于規(guī)?；a。

[1]MARKHAM K R. 黃酮類化合物結構鑒定技術[M]. 張寶琛, 唐崇實, 譯. 北京: 科學出版社, 1990.

[2]張培成. 黃酮化學[M]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2009.

[3]朱海揚, 曾慧蘭. 黃酮類化合物藥理作用的研究進展[J]. 山東醫(yī)藥, 2009, 49(17): 114-115.

[4]張志, 吳海健, 皮恩浩, 等. 柘樹黃酮體內外抗腫瘤作用研究[J]. 世界臨床藥物, 2009, 30(10): 601-605.

[5]韋翠萍, 周德華. 沙苑子黃酮對衰老模型小鼠的自由基代謝及免疫力的影響[J]. 中國全科醫(yī)學, 2010(2): 160-162.

[6]黃美麗. 萌發(fā)蕎麥種子內黃酮與蛋白質的動態(tài)變法及抗氧化性研究[D]. 北京: 中國農業(yè)大學, 2004.

[7]吳正平. 金花葵花總黃酮鎮(zhèn)痛作用的實驗研究[J]. 宜春學院學報, 2009, 31(4): 75-76.

[8]焦艷, 聞杰, 于曉紅, 等. 膜莢黃芪莖葉總黃酮對小鼠細胞免疫功能的影響[J]. 中國中西醫(yī)結合雜志, 1999, 19(6): 356-358.

[9]霍秀蘭, 鄭向黎. 養(yǎng)麥黃酮治療心腦血管病的有效成分研究[J]. 中國醫(yī)藥導報, 2006, 3(14): 250-251.

[10]張在超, 葉希韻, 徐敏華, 等. 葛根黃酮降血糖防止糖尿病并發(fā)癥的實驗研究[J]. 華東師范大學學報, 2010(2): 77-81.

[11]張彧, 高蔭榆, 張錫彬. 薯蔓提取物降血糖作用機理初探[J]. 食品科學, 2007, 28(12): 466-469.

[12]李鳳林, 李青旺, 馮彩寧, 等. 天然黃酮類化合物提取方法研究進展[J]. 中國食品添加劑, 2008(5): 60-64; 76.

[13]文良娟, 劉葦芬. 苦瓜黃酮的提取條件及其抗氧化活性研究[J]. 食品科學, 2007, 28(9): 183-186.

[14]田國政, 劉金龍, 鄭小江, 等. “恩五葉蜜”絞股藍總黃酮提取工藝研究[J]. 食品科學, 2008, 29(9): 285-287.

[15]王欽德, 楊堅. 食品試驗設計與統(tǒng)計分析[M]. 北京: 中國農業(yè)大學出版社, 2006: 330-349.

Optimization of Extraction Processing for Total Flavonoids from Osmunda japonica

TIAN Guo-zheng，HE Yi-fa
(School of Biological Science and Technology, Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000, China)

Osmunda japonica was used as the material to explore the optimal extraction processing for total flavonoids. The effects of ethanol concentration, soaking time, material-liquid ratio, and extraction temperature on extraction rate of total flavonoids from Osmunda japonica were investigated by orthogonal experiments. The optimal extraction processing parameters were ethanol concentration of 60%, extraction time of 1.5 h, material-liquid ratio of 1:25 (g/mL) and extraction temperature of 70℃. The extraction rate of total flavonoids from Osmunda japonica was up to 1.29% under the optimal extraction conditions. This extraction method is characteristics of low cost and high efficiency.

Osmunda japonica；total flavonoids；extraction；processing optimization.

O623.54

A

1002-6630(2010)22-0283-03

2010-08-30

湖北省教育廳重點項目(D20092904)；恩施州科技攻關項目(2007A06)

田國政(1964—)，男，高級實驗師，碩士，主要從事天然產物開發(fā)與利用研究。E-mail：tianguozheng@yahoo.com.cn