齊 斌，鄭麗雪，樸金苗

(1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.蘇州市食品生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 常熟 215500)

馬鈴薯分離蛋白的提取工藝

齊 斌1,2，鄭麗雪1，樸金苗1

(1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.蘇州市食品生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 常熟 215500)

采用鹽溶堿提酸沉法制備馬鈴薯分離蛋白，并對馬鈴薯分離蛋白提取條件和功能特性進(jìn)行研究。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳結(jié)果表明，馬鈴薯分離蛋白的亞基相對分子質(zhì)量較廣，其中分子質(zhì)量低于21.0kD的亞基較多。馬鈴薯分離蛋白的最佳提取工藝為料水比1:10(g/mL)、溫度40℃、pH8.0、NaCl濃度0.4mol/L。

馬鈴薯；分離蛋白；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳

馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)是世界第四大糧食作物。過去10年，我國馬鈴薯種植面積增加了30%。2007年，我國馬鈴薯總產(chǎn)量8000多萬噸，種植面積超過5663.67萬hm2，產(chǎn)量和面積均占到世界的22%，我國成為世界馬鈴薯生產(chǎn)第一大國[1]。研究表明，馬鈴薯能夠為膳食提供充足的礦物質(zhì)、VC、碳水化合物和蛋白質(zhì)，其中馬鈴薯蛋白的能量和營養(yǎng)價值明顯優(yōu)于大多數(shù)植物蛋白質(zhì)，與全雞蛋和酪蛋白相當(dāng)，是一種極具開發(fā)潛力的保健食品[2-4]。目前對馬鈴薯的研究主要集中于淀粉的開發(fā)利用及產(chǎn)前品質(zhì)的改良，而對馬鈴薯蛋白的研究報道較少。馬鈴薯蛋白質(zhì)通常作為廢物處理或干燥后配成飼料，既造成環(huán)境污染，又浪費了優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源[5-6]。所以，對馬鈴薯蛋白質(zhì)的開發(fā)利用，從中回收優(yōu)質(zhì)蛋白，對于提高馬鈴薯附加值、提高環(huán)保性能、發(fā)展可循環(huán)經(jīng)濟(jì)具有十分重要的作用。

本研究采用鹽溶堿提酸沉法制備馬鈴薯分離蛋白，通過單因素和正交試驗優(yōu)化提取工藝，并對其特性進(jìn)行研究，為深度開發(fā)和利用馬鈴薯蛋白質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯(中薯3號)；大豆色拉油、大豆分離蛋白 市售。

丙烯酰胺、N,N,N＇,N＇-四甲基乙二胺、過硫酸胺、三(羥甲基)胺基甲烷、低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白、十二烷基硫酸鈉、甲叉雙丙烯酰胺 Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1100液相色譜儀 Agilent公司；CR22GⅡ型冷凍離心機(jī) 日本日立有限公司；pH計 Mettler Toledo公司；電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 鹽溶堿提酸沉法的基本步驟

馬鈴薯分離蛋白(PPI)制備：馬鈴薯洗凈、切塊、打碎后，用一定濃度的NaCl水溶液(含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.12%亞硫酸鈉)室溫攪拌浸提1h，4℃，3000×g離心15min取上清液，用1mol/L HCl溶液調(diào)pH3.2左右，磁力攪

拌10min，靜止1h，4℃，3000×g離心15min，取沉淀溶解調(diào)pH7.0，凍干備用。

1.2.2 馬鈴薯分離蛋白提取工藝單因素試驗

1.2.2.1 料水比對馬鈴薯分離蛋白得率影響

料水比(g/mL)分別取1:4～1:12，靜止浸提1h，3000×g，4℃冷凍離心30min，溫度為室溫，pH值為9.5，NaCl濃度為0.3mol/L，測定上清液蛋白質(zhì)含量。

1.2.2.2 pH值對馬鈴薯分離蛋白得率影響

料水比1:10、溫度為室溫、NaCl濃度0.3mol/L，調(diào)節(jié)p H值分別為7、8、9、9.5、1 0，浸提1 h，3000×g，4℃冷凍離心30min，測定上清液蛋白質(zhì)含量。

1.2.2.3 溫度對馬鈴薯分離蛋白得率影響

料水比1:10、pH9.3、NaCl濃度0.3mol/L，調(diào)節(jié)不同溫度為2 5、3 0、4 0、5 0、6 0℃靜止浸提1 h，3000×g，4℃冷凍離心30min，測定上清液蛋白質(zhì)含量。

1.2.2.4 NaCl濃度對馬鈴薯分離蛋白得率影響

料水比1:10、pH10、溫度為室溫、調(diào)節(jié)不同NaCl濃度為0.2、0.3、0.5、0.8、1.0mol/L，靜止浸提1h，3000×g，4℃冷凍離心30min，測定上清液蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 馬鈴薯分離蛋白提取條件優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果進(jìn)行四因素三水平正交試驗。4個因素為料水比、pH值、溫度、NaCl濃度。正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.4 馬鈴薯分離蛋白氨基酸組成分析

樣品溶于一定量6mol/L鹽酸溶液中，移入水解管封管后，在110℃水解20～24h，切開封管，抽干后，采用OPA柱前自動衍生[7]，上液相色譜儀進(jìn)行氨基酸組成分析。

1.2.5 馬鈴薯分離蛋白SDS-PAGE電泳分析

采用Laemmli不連續(xù)凝膠配制[8]，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 1%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，蛋白質(zhì)量濃度為1mg/mL。采用穩(wěn)流操作，濃縮膠電流10mA，分離膠電流20mA。采用低相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)對照。采用考馬斯亮藍(lán)R250染色。

1.2.6 馬鈴薯蛋白得率的測定

蛋白質(zhì)濃度測定：采用Brandford法?？偟鞍踪|(zhì)含量：采用微量凱氏定氮法(N×6.25)。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯分離蛋白提取工藝單因素試驗

2.1.1 料水比對馬鈴薯分離蛋白得率的影響

圖1 料水比對馬鈴薯分離蛋白得率的影響Fig.1 Effect of material-liquid ratio on the yield of PPI

由圖1可見，馬鈴薯蛋白的得率隨提取溶劑的增加而增加。料液比從1:4變化到1:12，馬鈴薯蛋白的得率增加0.35%，說明增加提取溶劑的用量對從大豆粉中提取可溶性蛋白成分是有效的。但隨著提取溶劑增加會增加浸提液成本，對儀器設(shè)備的容量要求更高，過多的提取溶劑在實際生產(chǎn)和實驗室操作中會降低處理能力，而且當(dāng)料液比超過1:10后，蛋白提取率沒有明顯提高，因此選料液比1:10為宜。

2.1.2 pH值對馬鈴薯分離蛋白得率的影響

圖2 pH值對馬鈴薯分離蛋白得率的影響Fig.2 Effect of pH on the yield of PPI

由圖2可見，當(dāng)提取液pH值從7升到10時，馬鈴薯蛋白得率呈上升趨勢，當(dāng)提取液pH值為10時，得率超過0.7%。說明馬鈴薯蛋白大部分應(yīng)屬于堿溶性蛋

白?？紤]到強(qiáng)堿條件下蛋白質(zhì)會喪失食用價值。因此初步選取蛋白質(zhì)提取的較適pH值為10。

2.1.3 溫度對馬鈴薯分離蛋白得率的影響

圖3 溫度對馬鈴薯分離蛋白得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of PPI

由圖3可見，馬鈴薯蛋白得率隨溫度上升皆呈先升后降趨勢，以40℃時得率最高；45℃后顯著降低。溫度升高導(dǎo)致更多的蛋白質(zhì)變性可能是得率降低的主要原因，可見馬鈴薯分離蛋白對溫度的變化相對比較敏感。綜合分析提取溫度40℃較適宜。

2.1.4 NaCl濃度對馬鈴薯分離蛋白得率的影響

圖4 不同NaCl濃度對馬鈴薯分離蛋白得率的影響Fig.4 Effect of NaCl concentration on the yield of PPI

為使制備的馬鈴薯蛋白更符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)，采用NaCl水溶液作為蛋白提取液。實驗結(jié)果見圖4，隨提取液濃度的提高，馬鈴薯蛋白得率呈現(xiàn)先升后降的趨勢。當(dāng)NaCl溶液濃度較低時(＜0.5mol/L)，隨NaCl溶液濃度的提高，促進(jìn)了馬鈴薯蛋白質(zhì)的溶解，即鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，可保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性。當(dāng)NaCl濃度進(jìn)一步提高，高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，蛋白質(zhì)的溶解度下降。NaCl濃度為0.5mol/L時，馬鈴薯分離蛋白得率最高為0.46%，所以實驗中選用0.5mol/L NaCl水溶液為馬鈴薯蛋白的提取液。

2.2 優(yōu)化馬鈴薯分離蛋白提取工藝正交試驗

表2 正交試驗的極差分析Table2 Range analysis of orthogonal experiments

由表2極差分析結(jié)果表明：各因素對馬鈴薯分離蛋白提取率的影響大小為A＞C＞B＞D，最佳條件為A3B1C2D2，即確定料水比為1:10、溫度40℃、NaCl濃度0.4mol/L、pH8時的提取工藝條件為最優(yōu)組合。此條件下進(jìn)行馬鈴薯蛋白的提取，馬鈴薯分離蛋白的得率最大，達(dá)到了0.83%。且實驗條件溫和易于控制，工藝流程簡單易行，成本較低。

2.3 馬鈴薯分離蛋白的化學(xué)組成

表3 馬鈴薯分離蛋白的氨基酸組成分析Table3 Amino acid composition analysis of PPI

結(jié)果表明，馬鈴薯分離蛋白的干基含量為85.38%，與Refstie[9]和Nestares等[10]實驗結(jié)果相似。馬鈴薯分離

蛋白的水分為3.96%，灰分為4.33%，脂肪為0.37%。

馬鈴薯分離蛋白的氨基酸組成見表3。馬鈴薯分離蛋白的氨基酸總量為70.46%，低于Pastuszewska等[11]實驗結(jié)果，可能與馬鈴薯種類及種植條件有關(guān)。其中必需氨基酸含量為31.02%，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和賴氨酸的含量明顯高于FAO/WHO的推薦值，蛋氨酸和苯丙氨酸的含量稍低于FAO/WHO的推薦值[12]，色氨酸含量的損失可能是由于“酸沉”過程中強(qiáng)酸的加入破壞了蛋白質(zhì)的色氨酸[13]。非必需氨基酸含量為39.44%，其中天冬氨酸和谷氨酸的含量豐富，胱氨酸的含量最低。

2.4 馬鈴薯分離蛋白的SDS-PAGE電泳

圖5 馬鈴薯分離蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.5 SDS-PAGE electrophorogram of PPI

利用SDS-PAGE電泳分析馬鈴薯分離蛋白的組成，結(jié)果見圖5。泳道C是根據(jù)實驗中鹽溶堿提酸沉法制備的馬鈴薯分離蛋白，蛋白亞基條帶分布均勻，且條帶數(shù)明顯多于硫酸銨沉淀法制備的分離蛋白，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組成無明顯影響。電泳圖譜可分成兩個集中區(qū)域，上方區(qū)域中有分子質(zhì)量為60、41kD 的兩條主帶；下方區(qū)域中出現(xiàn)6個主帶，分子質(zhì)量分別為10、12、16、22、23、25kD。Zhu等[14]也研究認(rèn)為傳統(tǒng)的鹽溶堿提酸沉工藝是一種提取率較高，能夠較大程度地回收蛋白質(zhì)的方法。所以鹽溶堿提酸沉法可以作為馬鈴薯分離蛋白的提取方法。

3 結(jié) 論

3.1 采用鹽溶堿提酸沉法制備馬鈴薯分離蛋白，通過單因素試驗和正交試驗，對其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。實驗結(jié)果表明：料水比1:10、溫度40℃、pH8、NaCl濃度0.4mol/L條件下，馬鈴薯分離蛋白提取率最高，為0.83%。必需氨基酸含量為31.02%，具有很高的營養(yǎng)價值。

3.2 鹽溶堿提酸沉法制備的馬鈴薯分離蛋白亞基相分布均勻，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組成無明顯影響。鹽溶堿提酸沉工藝可作為馬鈴薯蛋白的提取方法。

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Extraction Processing of Potato Protein Isolate

QI Bin1,2，ZHENG Li-xue1，PIAO Jin-miao1
(1. School of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China；2. Suzhou Key Laboratory of Food and Biotechnology, Changshu 215500, China)

Potato protein isolate (PPI) was prepared from fresh potato by salt-soluble alkali extraction and acid precipitation. Extraction conditions and functional properties of PPI were investigated. SDS-PAGE revealed that PPI was composed of proteins with a broad range of molecular weights, especially rich in proteins with small molecular weight less than 21.0 kD. Meanwhile, the optimal extraction conditions were material-liquid ratio of 1:10 (g/mL), extraction temperature of 40 ℃, pH 8.0, and NaCl concentration of 0.4 mol/L.

potato；protein isolate；SDS-PAGE

TS215

A

1002-6630(2010)22-0297-04

2010-06-28

齊斌(1965—)，男，教授，博士，研究方向為糧食油脂與植物蛋白工程。E-mail：qibin64@126.com