趙 建，劉 璇，文 鏡*

(北京聯(lián)合大學(xué) 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191)

熒光分光光度計(jì)測(cè)定保健食品總抗氧化能力

趙 建，劉 璇，文 鏡*

(北京聯(lián)合大學(xué) 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191)

目的：建立用熒光分光光度計(jì)測(cè)定總抗氧化能力的方法。方法：以2,2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH)作為過(guò)氧自由基來(lái)源，sodium fluorescein(FL)為熒光指示劑，水溶性VE(trolox)為定量標(biāo)準(zhǔn)，熒光值半數(shù)衰減時(shí)間作為觀察指標(biāo)，測(cè)定6種保健食品的總抗氧化能力。結(jié)果：方法的最低檢測(cè)限為0.22μmol/L，線(xiàn)性回歸方程Y= 25.432X+2.0625，R2=0.9949，平行性精密度(RSD)3.5%，重復(fù)性精密度(RSD)3.9%，加標(biāo)回收率在90%～104%之間。結(jié)論：用熒光分光光度計(jì)可以測(cè)定保健食品總抗氧化能力。

食品檢測(cè)；總抗氧化能力；熒光分光光度法

生物活性物質(zhì)總抗氧化能力是物質(zhì)清除不同自由基或物質(zhì)的不同活性成分清除不同自由基的有效和，鑒于抗氧化活性物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)起作用的正是其總的抗氧化能力，因此可用總抗氧化能力(total antioxidant activity，TAA)來(lái)評(píng)價(jià)生物活性物質(zhì)的抗氧化功能[1-5]。

氧自由基吸收能力法(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)是近年來(lái)由Cao等[6-7]在Glazer[8]研究基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種總抗氧化能力測(cè)定方法。它是基于H原子轉(zhuǎn)移機(jī)制(HAT)的一種方法，其與生理相關(guān)性高于基于電子轉(zhuǎn)移(SET)機(jī)制的方法[9]，可以通過(guò)改變自由基和反應(yīng)體系的溶劑，測(cè)定脂溶性和水溶性物質(zhì)的抗氧化活性[10-14]。實(shí)驗(yàn)以2,2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH)作為過(guò)氧自由基來(lái)源，其與抗氧化劑的摩爾比非常高，使得方法專(zhuān)一性強(qiáng)[15-16]。方法中使用的熒光素(FL)不與待測(cè)樣品發(fā)生作用，不會(huì)干擾樣品的測(cè)定結(jié)果，因此對(duì)抗氧化劑測(cè)定具有特異性。

ORAC法使用自動(dòng)熒光酶標(biāo)儀作為測(cè)定儀器，由于該機(jī)器價(jià)格昂貴，限制了該方法的普及。與之相比，熒光分光光度計(jì)價(jià)格低廉、應(yīng)用廣泛，因此有必要研究用熒光分光光度測(cè)定天然產(chǎn)物及保健食品總抗氧化能力的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脂益康粉、蟲(chóng)草粉、紅曲粉、山竹粉、茄紅素營(yíng)養(yǎng)膠囊、景天養(yǎng)身膠囊均購(gòu)于同仁堂藥店。

熒光素(FL)、VE水溶性類(lèi)似物(trolox) Acros公司；2,2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH) 美國(guó)J&K Chemica公司；VC、環(huán)己烷、二甲亞砜、三水磷酸氫二鉀、二水磷酸二氫鈉(以上試劑均為分析純) 北京化工廠；去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

RF-5301 PC熒光分光光度計(jì) 日本島津公司；TDL-5-A型臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；BF211D電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；移液器德國(guó)艾本德股份公司。

1.3 方法

1.3.1 ORAC法原理

使用FL為氧化底物，AAPH為自由基產(chǎn)生劑。FL在有自由基作用下被氧化，熒光強(qiáng)度逐漸減弱；當(dāng)有抗氧化劑存在時(shí)，熒光強(qiáng)度減弱被抑制，且抗氧化劑對(duì)FL熒光強(qiáng)度的保護(hù)能力與其濃度呈正比。以抗氧化劑Trolox作為標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)定量樣品的抗氧化能力。

1.3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

分別移取FL使用液0.3mL和75mmol/L磷酸鹽緩沖液2.7mL，置于一潔凈干燥試管中，充分混合后用熒光分光光度計(jì)掃描吸收和發(fā)射光譜圖，確定最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。

1.3.3 AAPH用量選擇及在系統(tǒng)中釋放過(guò)氧自由基穩(wěn)定性觀察

用量選擇：AAPH不穩(wěn)定，易受pH值、溫度等因素的影響，需要現(xiàn)用現(xiàn)配，每次開(kāi)展新實(shí)驗(yàn)前，要重新確定其最佳用量，確定原則為FL熒光值半數(shù)衰減時(shí)間在5～15min為宜。

AAPH釋放過(guò)氧自由基的穩(wěn)定性觀察：在相對(duì)恒溫的環(huán)境下，用熒光半數(shù)衰減時(shí)間指標(biāo)對(duì)AAPH釋放過(guò)氧自由基的穩(wěn)定性進(jìn)行觀察。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制及方法可靠性分析

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

取Trolox儲(chǔ)備液(終濃度10μmol/L)加磷酸鹽緩沖液依次稀釋成濃度5.000、2.500、1.250、0.625、0.312、0.156μmol/L五個(gè)Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液。另設(shè)一支自由基對(duì)照(+AAPH)管、一只空白對(duì)照(-AAPH)管。各管分別加入終濃度63nmol/L FL使用液0.3mL，標(biāo)準(zhǔn)管加入75 mmol/mL磷酸鹽緩沖液0.3mL，五個(gè)濃度的Trolox 0.3mL，(+AAPH)管、(-AAPH)管分別加入75mmol/mL磷酸鹽緩沖液0.6mL和2.7mL，混勻，除(-AAPH)管外，其他各管分別加入終濃度4mmol/L AAPH 2.1mL，充分混勻，并開(kāi)始計(jì)時(shí)。以熒光半數(shù)衰減時(shí)間作為縱坐標(biāo)、Trolox濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。熒光半數(shù)衰減時(shí)間的記錄方法：以(-AAPH)管的熒光值為一個(gè)單位，當(dāng)熒光值降低到0.5個(gè)單位時(shí)所用的時(shí)間即熒光半數(shù)衰減時(shí)間。

1.3.4.2 最低檢測(cè)限下限

連續(xù)測(cè)定空白(+AAPH)熒光半數(shù)衰減時(shí)間8次，最低檢測(cè)限=3s/K。式中，s為標(biāo)準(zhǔn)偏差；K為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率。

1.3.4.3 平行性精密度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.01g山竹粉5份，分別測(cè)定總抗氧化能力并計(jì)算ORAC值及RSD值。具體方法如下：0.01g山竹粉加入3mL環(huán)己烷和3mL 75mmol/L磷酸鹽緩沖液，充分振蕩10min，再4000r/min離心10min，然后靜置使其自然分層。移出并保留上層環(huán)己烷提取液，再以同樣方法提取一次。合并兩次環(huán)己烷提取液，用于脂溶性成分總抗氧化能力測(cè)定；合并兩次水溶性提取液，用于水溶性總抗氧化能力測(cè)定。環(huán)己烷提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸至快干時(shí)，用氮?dú)獯蹈?。?mL二甲亞砜溶解，并用磷酸緩沖液適當(dāng)稀釋后用于樣品脂溶部分抗氧化能力的測(cè)定。測(cè)定方法操作參照1.3.4.1節(jié)，注意溶劑對(duì)照管中要加入等量的二甲亞砜，代替(+AAPH)管。結(jié)果ORAC值以μmol Trolox/g樣品表達(dá)。水提取液，直接(或用75mmol/L磷酸鹽緩沖液適當(dāng)稀釋后)用于樣品水溶部分抗氧化能力的測(cè)定。樣品脂溶與水溶成分總抗氧化能力相加即為樣品的總抗氧化能力。

1.3.4.4 重復(fù)性精密度實(shí)驗(yàn)

山竹樣品連續(xù)測(cè)定5d，方法同1.3.4.3節(jié)。記錄熒光半數(shù)衰減時(shí)間，計(jì)算ORAC值及RSD。

1.3.4.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.01g山竹粉2份，其中1份定量加入0.00250g Trolox(即10μmol Trolox)。按1.3.4.3節(jié)方法平行操作。重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次，計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.3.5 樣品總抗氧化能力檢測(cè)

操作方法同1.3.4.3節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)

設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，掃描發(fā)射波長(zhǎng)，最大發(fā)射光譜峰在512nm(圖1)。設(shè)定發(fā)射波長(zhǎng)為512nm，掃描激發(fā)波長(zhǎng)，最大激發(fā)光譜峰在491nm(圖2)。因此，確定最佳激發(fā)、發(fā)射波長(zhǎng)分別為491nm和512nm。

圖1 FL發(fā)射光譜圖Fig.1 Emission spectrum of sodium fluorescein

圖2 FL激發(fā)光譜圖Fig.2 Excitation spectrum of sodium fluorescein

2.2 試劑用量與AAPH在系統(tǒng)中釋放過(guò)氧自由基穩(wěn)定性觀察

FL熒光值在AAPH作用下衰減速度不宜過(guò)快。過(guò)快，樣品的熒光半數(shù)衰減時(shí)間不容易拉開(kāi)，靈敏度會(huì)降低。但也不宜過(guò)慢而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)時(shí)間增加。經(jīng)反復(fù)測(cè)試，在本實(shí)驗(yàn)室條件下，AAPH溶液終濃度4mmol/L時(shí)FL熒光衰減速度適宜。

AAPH釋放過(guò)氧自由基的速度具有一定的波動(dòng)性，由圖3可知，在試劑配制4h以后，熒光半數(shù)衰減時(shí)間出現(xiàn)上升趨勢(shì)，說(shuō)明過(guò)氧自由基釋放速度有所減緩。

圖3 AAPH釋放過(guò)氧自由基隨時(shí)間變化的影響Fig.3 Change of peroxy free radical release from AAPH as the time change

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及方法可靠性分析

2.3.1 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熒光半數(shù)衰減時(shí)間與Trolox濃度有良好線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為Y=25.43X＋2.062，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為0.9949(圖4)。

圖4 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.4 Standard curve of Trolox

2.3.2 方法可靠性分析

2.3.2.1 最低檢測(cè)下限

表1 最低檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果Table1 The minimum detection limit of the established method

表1結(jié)果表明，該方法最低檢測(cè)限為0.22μmol/L。通過(guò)幾種保健食品的總抗氧化能力測(cè)定，其數(shù)值在102～103μmol/g，所以此方法完全可以滿(mǎn)足測(cè)定需要。

2.3.2.2 平行性精密度實(shí)驗(yàn)

表2 平行性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of parallel experiments

表2結(jié)果表明，方法平行性精密度為3.5%，說(shuō)明該方法的平行精密度良好，測(cè)定結(jié)果較滿(mǎn)意。

2.3.2.3 重復(fù)性精密度實(shí)驗(yàn)

表3結(jié)果表明，方法重復(fù)性精密度為3.9%，說(shuō)明

該方法的重復(fù)性良好，測(cè)定條件易控制，測(cè)定結(jié)果較滿(mǎn)意。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table3 Results of repeatability experiments

2.3.2.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

表4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table4 Results of recovery experiments with spiked samples

表4結(jié)果表明，加標(biāo)回收率范圍為90%～104%，與熒光酶標(biāo)儀測(cè)定總抗氧化能力的加標(biāo)回收率相差不大[11]，回收率結(jié)果比較好，說(shuō)明本測(cè)量方法的誤差較小，可以作為本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定方法。

2.4 測(cè)定保健品總抗氧化能力

綜合考慮保健食品脂溶性部分和水溶性部分抗氧化能力，作為保健食品的總抗氧化能力。6種保健食品均準(zhǔn)確稱(chēng)取0.01g。為了保證在工作曲線(xiàn)內(nèi)測(cè)定，用75mmol/L磷酸鹽緩沖液對(duì)提取液進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 保健食品總抗氧化能力Table5 Total antioxidant capacity of health food

表5結(jié)果表明，紅曲、山竹、景天養(yǎng)身水溶部分抗氧化能力優(yōu)于脂溶部分；蕃紅素、蟲(chóng)草、脂益康脂溶部分抗氧化能力優(yōu)于水溶部分。

3 討 論

ORAC法是基于HAT機(jī)制的方法，與經(jīng)典的脂質(zhì)過(guò)氧化的方法類(lèi)似，最接近生理真實(shí)的氧化過(guò)程。因此，ORAC法應(yīng)用在保健食品抗氧化能力檢測(cè)具有重要意義，它既可以直接檢測(cè)保健食品的總抗氧化能力，其中脂溶性和水溶性?xún)刹糠挚寡趸芰梢苑謩e評(píng)價(jià)；也可以測(cè)定攝入保健食品前后動(dòng)物血液或臟器總抗氧化能力，并根據(jù)其變化情況，進(jìn)行兩者相關(guān)性研究，為保健食品的研發(fā)提供重要依據(jù)。

ORAC法在我國(guó)開(kāi)展的并不普遍，主要原因是受到了儀器設(shè)備的限制。本實(shí)驗(yàn)用熒光分光光度計(jì)替代全自動(dòng)熒光酶標(biāo)儀，用熒光半數(shù)衰減時(shí)間替代熒光衰退曲線(xiàn)下面積，建立了新的實(shí)驗(yàn)方法。首先確定了熒光分光光度計(jì)的最佳激發(fā)、發(fā)射波長(zhǎng)分別為491nm和512nm。由于ORAC法是由FL、AAPH和抗氧化劑(樣品或標(biāo)準(zhǔn)Trolox)組成的一個(gè)三元結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)體系。FL的熒光非常穩(wěn)定，AAPH產(chǎn)生的過(guò)氧自由基能夠使FL氧化導(dǎo)致熒光衰退，抗氧化劑捕捉自由基保護(hù)FL不被氧化，同時(shí)其不與FL反應(yīng)，不會(huì)影響FL的熒光值，因此實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性的好壞以及方法可靠性的關(guān)鍵在于AAPH釋放過(guò)氧自由基的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AAPH釋放過(guò)氧自由基具有一定的波動(dòng)性，試劑放置4h以上，自由基釋放速度有下降趨勢(shì)。因此，在測(cè)定樣品同時(shí)要帶一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和空白(+AAPH)。

用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光衰退曲線(xiàn)下面積費(fèi)時(shí)費(fèi)力。測(cè)定一個(gè)樣品需要間隔2min測(cè)一個(gè)數(shù)據(jù)，連續(xù)測(cè)定120min。如果能用熒光半數(shù)衰減時(shí)間替代熒光衰退曲線(xiàn)下面積，則只需要測(cè)定2個(gè)數(shù)據(jù)，時(shí)間約為40min。從圖4可以看到熒光半數(shù)衰減時(shí)間與Trolox濃度有良好線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為Y=25.43X+2.062，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為0.9949。本實(shí)驗(yàn)在研究中用熒光衰退曲線(xiàn)下面積為觀察指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，其與Trolox濃度的線(xiàn)性方程為Y= 26.03X－0.2578，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為0.9941。說(shuō)明完全可以用熒光半數(shù)衰減時(shí)間替代熒光衰退曲線(xiàn)下面積作為抗氧化能力的觀察指標(biāo)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及方法可靠性分析顯示：方法的最低檢測(cè)限為0.22μmol/L、線(xiàn)性回歸方程Y=25.43X+2.062，R2= 0.9949、平行性精密度RSD=3.5%、重復(fù)性精密度RSD為3.9%、加標(biāo)回收率在90%～104%之間，說(shuō)明用熒光分光光度計(jì)可以測(cè)定保健食品總抗氧化能力。

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Total Antioxidant Capacity Determination of Health Food by Fluorescence Spectrophotometer

ZHAO Jian，LIU Xuan，WEN Jing*
(Beijing Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Foods, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

Objective: To establish a determination method of total antioxidant capacity by fluorescence spectrophotometer. Methods: Total antioxidant capacity of health food were determined by a fluorescence method using AAPH as the source of peroxy free radicals, sodium fluorescein (FL) as the fluorescent indicator, water-soluble vitamin E (Trolox) as the quantitative standard and half fluorescence decay time as the observation index. Results: This established method had the detection limit of 0.22 μmol/L, linear regression equation of Y = 25.432X + 2.0625 with a coefficient constant of 0.9949, parallel precision of 3.5% and repeatability precision of 3.9%. The recovery rates of spiked samples were in the range of 90%－104% through the determination of six health food samples. Conclusion: Fluorescence spectrophotometer can be used for total antioxidant capacity of health food.

food test；total antioxidant capacity；fluorescence spectrophotoscopy

TS207.3

A

1002-6630(2010)22-0301-05

2010-03-09

北京市教委科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(KM201011417006)

趙建(1972—)，男，工程師，學(xué)士，主要從事保健食品功能評(píng)價(jià)研究。E-mail：zhaojian@ygi.edu.cn

*通信作者：文鏡(1952—)，男，教授，學(xué)士，主要從事保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)機(jī)理和方法學(xué)研究。E-mail：wenjing@ygi.edu.cn