馬寅眾，陳江源，房國(guó)梁，李 琦，李 睿，周幗萍，劉志國(guó),*

(1.武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.江漢大學(xué)衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430016)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法快速檢測(cè)阪崎腸桿菌

馬寅眾1，陳江源2，房國(guó)梁1，李 琦1，李 睿1，周幗萍1，劉志國(guó)1,*

(1.武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.江漢大學(xué)衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430016)

目的：研究阪崎腸桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，簡(jiǎn)稱LAMP)方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中阪崎腸桿菌的快速檢測(cè)。方法：針對(duì)阪崎腸桿菌16S rRNA基因(16S rDNA)及外膜蛋白A(OmpA)基因設(shè)計(jì)LAMP引物，擴(kuò)增后通過(guò)電泳或加入顯色劑SYBR-GREENⅠ檢測(cè)。結(jié)果：LAMP法能有效特異地檢測(cè)出阪崎腸桿菌；以16S rRNA引物檢測(cè)阪崎腸桿菌的最低檢出限為32CFU/mL，用OmpA引物檢測(cè)阪崎腸桿菌的最低檢出限達(dá)3CFU/mL，擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBR-GREENⅠ在紫外條件下可見(jiàn)熒光，與電泳檢測(cè)具有同樣的靈敏度。結(jié)論：LAMP法可實(shí)現(xiàn)對(duì)阪崎腸桿菌的快速檢測(cè)，在食品檢測(cè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

阪崎腸桿菌；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；快速檢測(cè)

阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)屬腸桿菌科、腸桿菌屬的革蘭陰性無(wú)芽孢短小桿菌，為人和動(dòng)物的腸道寄生菌和條件致病菌。阪崎腸桿菌毒力強(qiáng)，能導(dǎo)致新生兒腦膜炎、致死性小腸結(jié)腸炎和菌血癥等疾病，盡管使用抗生素治療可以康復(fù)，但伴隨著嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥、發(fā)育障礙等癥狀，由該菌引起的感染死亡率高達(dá)50%以上[1-2]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)阪崎腸桿菌的檢測(cè)多采用常規(guī)的分離培養(yǎng)生化鑒定方法[2-3]，最近，常規(guī)PCR方法和實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)也被運(yùn)用于該菌的檢測(cè)[4-5]。但這些方法周期長(zhǎng)、需要專業(yè)設(shè)備且費(fèi)用高。

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediated isothermal

amplification，LAMP)是Notomi等[6]于2000年開(kāi)發(fā)的一種新的恒溫核酸擴(kuò)增方法。利用特異引物及鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件下自循環(huán)幾十分鐘就可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。該法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、簡(jiǎn)便、易檢測(cè)等特點(diǎn)，現(xiàn)已用于多種細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)、真菌等病原體的檢測(cè)[7-10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)16S rRNA及OmpA兩套LAMP引物，建立阪崎腸桿菌LAMP快速檢測(cè)法，并通過(guò)比較兩套引物的特異性及靈敏度選擇其中較好的一套引物用于實(shí)際檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阪崎腸桿菌CICC 21544(Enterobacter sakazakii CICC 21544) 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；大腸桿菌DH5 α(E.coli DH5α)、大腸桿菌BL21(DE3，E.coli BL21) 本實(shí)驗(yàn)室保存；蠟樣芽孢桿菌ATCC 33018(Bacillus cereus ATCC 33018)、枯草芽孢桿菌JXBS-1(B. subtilis JXBS-1)、炭疽芽孢桿菌CMCC 63605(Bacillus anthracis CMCC 63605)、金黃色葡萄球菌 JXSA-1(Staphylococcus aureus JXSA-1)、分枝桿菌WHTY7-1-4(Mycobacteria WHTY7-1-4)、醋酸菌FPYS1(Acetobacter FPYS1)、土壤桿菌BJTY-4 (Sphingomonas BJTY-4) 中國(guó)科學(xué)院武漢分院。

Bst DNA聚合酶 紐英倫生物技術(shù)有限公司；LAMP引物由上海生工生物工程有限公司合成；SYBR-GREEN I、dNTPs、DNA Marker DL100 上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴箱 武漢市琴臺(tái)醫(yī)療器械廠；YJ-1450超凈工作臺(tái) 江蘇蘇州凈化設(shè)備公司；UNO Ⅱ聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀 德國(guó)Whatman Biometra公司；核酸電泳儀北京六一廠；UV-2000 GIS紫外分析儀 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA制備

煮沸法[11-12]制備DNA：取阪崎腸桿菌細(xì)菌純培養(yǎng)物100μL于12000r/min離心5min，棄上清液，加入100μL無(wú)菌水混勻后，于100℃水浴15min裂解，冰浴2min，然后4℃、12000r/min離心5min，取4.0μL上清液用于LAMP擴(kuò)增。

1.3.2 LAMP檢測(cè)

通過(guò)Genebank Blast比對(duì)，選擇阪崎腸桿菌16S rRNA(AY803190)及OmpA(DQ000206)基因序列作為設(shè)計(jì)LAMP引物的靶序列。分別設(shè)計(jì)16S rRNA和OmpA的外引物(F3、B3)和內(nèi)引物(FIP、BIP)見(jiàn)表1。

表1 16S rRNA及OmpA的LAMP引物Table1 LAMP primers of 16S rRNA and OmpA

LAMP反應(yīng)體系25μL含1.6μmol FIP、1.6μmol BIP、0.2μmol F3、0.2μmol B3、20mmol Tris-HCl(pH8.8)、10mmol KCl、2mmol MgSO4、10mmol (NH4)2SO4、 0.1% Triton X-100、1.4 mmol dNTPs、8U Bst DNA聚合酶、4.0μL模板DNA。先將除Bst DNA聚合酶以外的所有反應(yīng)物在95℃水浴5min，然后迅速放在冰上冷卻，冷卻后加入Bst DNA聚合酶，63℃孵育40min，80℃孵育10min終止酶活性即完成了LAMP反應(yīng)。LAMP產(chǎn)物產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析或直接加入SYBRGREENⅠ0.1μL在紫外條件下檢測(cè)熒光性，快速判斷LAMP反應(yīng)是否發(fā)生[13]。

1.3.3 LAMP的特異性檢測(cè)

用煮沸法制備大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21 (DE3)、 蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、分枝桿菌、醋酸菌、土壤桿菌DNA模板，分別用16S rRNA及OmpA引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，以檢測(cè)引物的特異性。

1.3.4 阪崎腸桿菌LAMP法靈敏度的檢測(cè)

通過(guò)序列稀釋接種，平板菌落計(jì)數(shù)檢測(cè)菌濃度。用無(wú)菌三蒸水分別稀釋模板至109倍，將每個(gè)稀釋濃度進(jìn)行LAMP反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析或加入顯色劑SYBR-GREENⅠ，檢測(cè)LAMP靈敏度，計(jì)算檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 阪崎腸桿菌LAMP法檢測(cè)

對(duì)阪崎腸桿菌DNA模板分別用16S rRNA及OmpA LAMP引物進(jìn)行擴(kuò)增，均有陽(yáng)性結(jié)果。如圖1A所示產(chǎn)物是由若干莖環(huán)結(jié)構(gòu)和類似花椰菜結(jié)構(gòu)的DNA組成的混合物，電泳后在凝膠上顯現(xiàn)出典型的梯狀條帶。反應(yīng)結(jié)束后分別加入0.1μL SYBR-GREENⅠ在紫外下觀察，見(jiàn)圖1B、1C，其中無(wú)模板組無(wú)熒光反應(yīng)，而擴(kuò)增陽(yáng)性組呈現(xiàn)明顯的熒光反應(yīng)。因此SYBR-GREENⅠ可用于LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的快速顯示。

圖1 阪崎腸桿菌16S rRNA及OmpA LAMP反應(yīng)檢測(cè)Fig.1 LAMP detection of Enterobacter sakazakii 16S rRNA and OmpA

2.2 阪崎腸桿菌LAMP反應(yīng)的特異性

針對(duì)阪崎腸桿菌16S rRNA及OmpA設(shè)計(jì)的LAMP引物分別對(duì)阪崎腸桿菌和非阪崎腸桿菌DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)。如圖2A所示，用16S rRNA引物L(fēng)AMP擴(kuò)增時(shí)除了阪崎腸桿菌有梯狀條帶產(chǎn)生外，大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21(DE3)也有梯狀條帶產(chǎn)生；用OmpA引物L(fēng)AMP擴(kuò)增時(shí)只有阪崎腸桿菌有梯狀條帶產(chǎn)生，其他均為陰性(圖2B)。結(jié)果顯示，OmpA LAMP引物要比16S rRNA引物的特異性高。通過(guò)Blast發(fā)現(xiàn)阪崎腸桿菌的16S rRNA與大腸桿菌DH5α及大腸桿菌BL21(DE3)16S rRNA序列之間的相似度高達(dá)99%，所以檢測(cè)呈現(xiàn)陽(yáng)性，而其他菌株與阪崎腸桿菌種屬關(guān)系較遠(yuǎn)所以檢測(cè)為陰性。

圖2 阪崎腸桿菌16S rRNA和OmpA LAMP反應(yīng)特異性檢測(cè)Fig.2 Detection specificity of LAMP reaction for Enterobacter sakazakii 16S rRNA and OmpA

2.3 阪崎腸桿菌LAMP檢測(cè)的靈敏度

通過(guò)平板計(jì)數(shù)法算出阪崎腸桿菌菌濃度為3.2×109個(gè)菌/mL，用無(wú)菌三蒸水將模板以10倍梯度稀釋至109倍，每個(gè)稀釋度分別用16S rRNA引物和OmpA引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。電泳顯示當(dāng)模板稀釋107倍時(shí)16S rRNA引物L(fēng)AMP擴(kuò)增仍可檢測(cè)出(圖3A)；當(dāng)模板稀釋108倍時(shí)OmpA引物L(fēng)AMP擴(kuò)增仍可檢測(cè)出(圖3B)。換算出阪崎腸桿菌的檢出限，16S rRNA引物L(fēng)AMP擴(kuò)增檢測(cè)阪崎腸桿菌的最低檢出限為32CFU/mL；而OmpA引物的最低檢出限為3CFU/mL。反應(yīng)結(jié)束后各管加入0.1μL SYBR-GREENⅠ在紫外下檢測(cè)，當(dāng)模板稀釋107倍時(shí)16S rRNA引物進(jìn)行LAMP反應(yīng)產(chǎn)物仍能呈現(xiàn)出熒光(圖3C)；而模板稀釋108倍時(shí)OmpA引物的LAMP產(chǎn)物仍能呈現(xiàn)出熒光。說(shuō)明利用SYBR-GREENⅠ具有與電泳同樣的靈敏度，可代替電泳法實(shí)現(xiàn)阪崎腸桿菌的快速檢測(cè)。

圖3 阪崎腸桿菌16S rRNA和OmpA LAMP反應(yīng)靈敏度檢測(cè)Fig.3 Detection sensitivity of LAMP reaction for Enterobacter sakazakii 16S rRNA and OmpA

3 討 論

由于阪崎腸桿菌能引起嚴(yán)重的新生兒腦膜炎、小腸結(jié)腸炎和菌血癥等癥狀，死亡率高達(dá)50%，因此對(duì)該菌的及時(shí)檢測(cè)十分重要。盡管免疫學(xué)檢測(cè)方法在微生物檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用[14-15]，但尚未有針對(duì)阪崎腸桿菌的免疫學(xué)快檢方法。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)阪崎腸桿菌的檢測(cè)多采用微生物學(xué)方法，通過(guò)常規(guī)的分離培養(yǎng)及生化鑒定。近年來(lái)，一些針對(duì)核酸的檢測(cè)方法迅速發(fā)展，如采用普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR方法等，這些方法也具有快速檢測(cè)的特點(diǎn)，但在特異性和靈敏度上尚有不足，且設(shè)備要求高，不太適用于基層的檢測(cè)要求。而采用LAMP檢測(cè)方法可彌補(bǔ)這些不足。

有文獻(xiàn)報(bào)道，針對(duì)阪崎腸桿菌的16S～23S rRNA間區(qū)序列(ITS)設(shè)計(jì)LAMP引物成功檢測(cè)出阪崎腸桿菌[16]。但是由于16S～23S rRNA間區(qū)序列進(jìn)化上的保守度高，同一種屬之間的差異非常小，因此檢測(cè)的特異性較低，

易導(dǎo)致較多的假陽(yáng)性結(jié)果。為此，本實(shí)驗(yàn)選擇設(shè)計(jì)了針對(duì)阪崎腸桿菌16S rRNA和OmpA的LAMP引物，增加了檢測(cè)的特異性。

特異性分析中選用了大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21(DE3)、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、分枝桿菌、醋酸菌、土壤桿菌等菌株，對(duì)比檢測(cè)16S rRNA引物及OmpA引物的特異性。結(jié)果顯示：大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21 (DE3)用16S rRNA引物擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)了假陽(yáng)性，而OmpA引物擴(kuò)增均為陰性，說(shuō)明OmpA引物的特異性高于16S rRNA引物特異性。進(jìn)一步對(duì)OmpA引物的擴(kuò)增靶序列進(jìn)行Blast分析，一致性較高的有沙門(mén)氏菌、志賀氏菌，對(duì)這些菌的16S rRNA進(jìn)行Blast分析，顯示它們具有較低的一致性。這表明，同時(shí)檢測(cè)這兩個(gè)靶序列可大大提高檢測(cè)的特異性。

此外，本實(shí)驗(yàn)采用熒光染料SYBR-GREENⅠ替代凝膠電泳，使檢測(cè)結(jié)果的觀察更加直觀、簡(jiǎn)潔，再結(jié)合該法高靈敏度和特異性強(qiáng)，使其更適合推廣應(yīng)用，在食品中阪崎腸桿菌的檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Rapid Detection of Enterobacter sakazakii by LAMP

MA Yin-zhong1，CHEN Jiang-yuan2，F(xiàn)ANG Guo-liang1，LI Qi1，LI Rui1，ZHOU Guo-ping1，LIU Zhi-guo1,*
(1. School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China；2. School of Health Science, Jianghan University, Wuhan 430016, China)

Objective: To develop a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for rapid detection of Enterobacter sakazakii in food. Methods: LAMP primers were designed on the basis of 16S rRNA gene (16S rDNA) and outer membrane protein A gene (OmpA) in Enterobacter sakazakii. The LAMP products were evaluated by electrophoresis or SYBR-GREEN I. Results: The detection limit of Enterobacter sakazakii by LAMP assay was 32 CFU/mL using 16S rRNA primers or 3 CFU/mL using OmpA primers. The similar detection sensitivity of LAMP products using SYBR-GREEN I and electrophoresis was observed. Conclusion: LAMP method was effective and sensitive for rapidly detecting Enterobacter sakazakii, which will have a broad application prospect in food.

Enterobacter sakazakii；loop-mediated isothermal amplification；detection

Q93.3

A

1002-6630(2010)22-0322-04

2010-06-30

武漢市科技局對(duì)外科技合作與交流計(jì)劃項(xiàng)目(201070934341)；武漢工業(yè)學(xué)院研究生創(chuàng)新基金重點(diǎn)項(xiàng)目(09cx002)

馬寅眾(1986—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩c食品檢測(cè)技術(shù)。E-mail：sdjnhr@163.com

*通信作者：劉志國(guó)(1963—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)與食品安全。E-mail：zhiguo-1@126.com