苗子健，李從發(fā)，唐艷平，熊海波，侯源源，劉四新*

(海南大學(xué)食品學(xué)院，海南 ?？?570228)

腰果梨抑菌活性物質(zhì)提取工藝優(yōu)化

苗子健，李從發(fā)，唐艷平，熊海波，侯源源，劉四新*

(海南大學(xué)食品學(xué)院，海南 ?？?570228)

對腰果梨抑菌活性物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行研究，分析比較提取物對不同測試菌的抑菌效果。以金黃色葡萄球菌和白色念珠菌為指示菌，在單因素試驗基礎(chǔ)上通過中心組合試驗設(shè)計分別對黃色、紅色兩種不同色澤腰果梨進(jìn)行提取工藝優(yōu)化。得出黃色腰果梨最佳提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度85℃，料液比1:13.9，提取時間2.65h；紅色腰果梨最佳提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度85℃，料液比1:14.5，提取時間2.44h。經(jīng)工藝優(yōu)化后腰果梨提取物顯著提高了抑菌效果。

腰果梨；抑菌；提取工藝；中心組合試驗

腰果(Anacardium occidentale L.)是世界著名四大堅果之一。腰果樹是多年生常綠喬木，耐旱、耐瘠，而抗寒力弱，是典型的熱帶果樹[1]。腰果梨是在腰果堅果成熟過程中由花梗膨大而形成的一種梨形“水果”，為腰果生產(chǎn)副產(chǎn)品，約占腰果樹總產(chǎn)出量的90%左右[2]。這種柔軟多汁的纖維質(zhì)“水果”含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和多酚類物質(zhì)：水分87.8%、碳水化合物11.6%、蛋白質(zhì)0.2%、脂肪0.1%，還含有多種維生素和鈣、磷、鐵等礦物元素，特別富含VC[3-4]。目前對腰果梨的商業(yè)利用還不多，國外主要是制作腰果梨汁，國內(nèi)主要是制作腰果梨酒，果香濃郁，滋味醇厚，風(fēng)味獨特。實踐應(yīng)用表明腰果梨酒對口腔潰瘍類疾患具有十分明顯的治愈效果。

近幾年的研究證實，各種天然物質(zhì)如大蒜、蘆薈、茶葉等的提取物都具有不同程度的抑菌作用[5]，與傳統(tǒng)化學(xué)抑制劑相比，這類天然抑菌物質(zhì)來源廣泛，加工低廉，且可作為輔助成分改變產(chǎn)品的風(fēng)味，如在牙膏中添加荷葉提取物等[6]。本研究主要對腰果梨鮮果的抑菌活性進(jìn)行探索，研究腰果梨抑菌活性成分的提取優(yōu)化情況，為腰果梨資源的高效利用及腰果梨酒的市場開拓奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腰果梨由海南省腰果研究中心提供。

唾液鏈球菌CGMCC 1.2498、金黃色葡萄球菌CGMCC 1.72 中國科學(xué)院微生物研究所；表皮葡萄球菌CBL-R、表皮葡萄球菌TS5 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；白色念珠菌、變形桿菌、大腸桿菌 海南大學(xué)食品學(xué)院微生物實驗室。

NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基[7]、腦心浸萃瓊脂培養(yǎng)基和腦心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；搖床 太倉市博萊特實驗儀器廠；超凈工作臺 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；超聲波清洗機 寧波海曙五方超聲設(shè)備有限公司；電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；G154DW立式高壓滅菌器 美國ZEALWAY儀器公司；RE-5298旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；722可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司；粉碎機 青州三陽包裝設(shè)備有限公司；電子天平、實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；XW-80A旋渦混合器上海精科實業(yè)有限公司；電子萬用爐 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 腰果梨提取物制備

將腰果梨洗凈后60℃烘干，粉碎，過40目篩[8]，繼續(xù)烘干至質(zhì)量恒定。稱取不同顏色(紅、黃)的腰果梨10g，用提取劑(如乙醇溶液)進(jìn)行水浴回流提取。真空抽濾后將干粉回收，用同樣的方法進(jìn)行二次提取，合并兩次提取液，減壓濃縮至1g/mL(指每毫升提取物含1g腰果梨干粉)[9-10]。

1.3.2 抑菌試驗

標(biāo)準(zhǔn)比濁液的配制：取質(zhì)量濃度11.75g/L BaCl2· 2H2O溶液0.5mL，加入到99.5mL 0.184mol/L H2SO4溶液中，裝入試劑瓶或均勻分裝至試管內(nèi)密封保存。該濁度相當(dāng)于抑菌試驗所需菌懸液濃度1.5×108CFU/mL[11]。

首先將各供試菌用相應(yīng)的液態(tài)培養(yǎng)基于37℃、140r/ min活化18～24h，然后將活ss化后的菌液用無菌生理鹽水稀釋至標(biāo)準(zhǔn)比濁管濁度(通過可見分光光度計560nm測透光率)。白色念珠菌直接從PDA斜面上刮取菌苔混入無菌生理鹽水中，漩渦震蕩均勻后與標(biāo)準(zhǔn)管比濁，通過血球計數(shù)板校正菌懸液濃度。吸取1mL菌懸液，加入到50℃已融化的瓊脂培養(yǎng)基中。充分混勻后倒入內(nèi)徑一致的無菌平皿內(nèi)，做三組平行，待用。

將直徑5.5mm的無菌干濾紙片浸泡于腰果梨提取物中，取出后以無菌風(fēng)吹干，再通過無菌操作貼放于上述瓊脂平板上[12]。20min后將培養(yǎng)皿倒置、于37℃或28℃(白色念珠菌)恒溫培養(yǎng)。24h后觀察并測量抑菌圈直徑。每個平皿均以400U/mL的慶大霉素作陽性對照，以相同提取條件下的空白提取液作陰性對照。

1.3.3 單因素試驗

對提取溶劑、溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比、提取時間、提取pH值不同的提取條件進(jìn)行試驗研究。以金黃色葡萄球菌和白色念珠菌作為指示菌，將不同條件下的提取物分別進(jìn)行抑菌試驗。

1.3.4 提取工藝參數(shù)優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用中心組合設(shè)計法研究溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比、提取時間對抑菌效果的綜合影響，用SAS Windows 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理以優(yōu)化腰果梨的提取工藝條件。因素編碼見表1。

表1 中心組合設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of central composite experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑提取物對抑菌作用的影響

由表2和表3可知：70%乙醇提取物對各供試菌的抑制作用均優(yōu)于其他幾種溶劑。通過Duncan比較發(fā)現(xiàn)：對于金黃色葡萄球菌和變形桿菌的抑制作用，70%乙醇與其他幾種溶劑間均存在顯著性差異。

表2 黃色腰果梨不同溶劑提取物抑菌圈直徑Table 2 Inhibitory zone diameters of yellow cashew apple extracts using different extraction solventsmm

表3 紅色腰果梨不同溶劑提取物抑菌圈直徑Table 3 Inhibitory zone diameters of red cashew apple extracts using different extraction solventsmm

2.2 乙醇提取物對不同供試菌抑菌效果的比較

在提取溫度90℃、pH3，料液比1:10和提取時間1.5h的提取條件下，研究70%乙醇提取物對各供試菌的抑菌效果。結(jié)果表明(圖1)其對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌具有很強的抑菌效果。經(jīng)Duncan比較得知：這兩株菌與其他各供試菌之間具有顯著性差異，故選用金黃色葡萄球菌和白色念珠菌作為提取試驗的指示菌；黃色腰果梨與紅色腰果梨提取物的該項抑菌結(jié)果一致、之間沒有顯著性差異。

圖1 腰果梨70%乙醇提取物抑菌效果比較Fig.1 Antibacterial effects of extracts from yellow and red cashew apple using 70% ethanol extraction

2.3 提取單因素試驗

2.3.1 溶劑體積分?jǐn)?shù)對抑菌效果的影響

如圖2所示：隨著溶劑體積分?jǐn)?shù)的增大，腰果梨提取物抑菌活性先增大再減小，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%時，腰果梨提取物抑菌效果最好。據(jù)相似相溶原理推測，可知70%乙醇極性較適合腰果梨中抑菌物質(zhì)的提取。

圖2 溶劑體積分?jǐn)?shù)對腰果梨抑菌效果的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on antibacterial activity of extract from cashew apple

2.3.2 提取溫度的影響

隨提取溫度升高抑菌作用逐漸增強(圖3)，當(dāng)溫度達(dá)90℃時，提取物對兩種菌的抑菌圈直徑均達(dá)最大，抑菌效果最好，但隨著溫度繼續(xù)升高，抑菌效果反而降低；這可能是高溫破壞了抑菌物成分的結(jié)構(gòu)。

圖3 提取溫度對腰果梨抑菌效果的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on antibacterial activity of extract from cashew apple

2.3.3 提取料液比的影響

腰果梨提取物的抑菌作用隨著料液比的增加而增強，但到一定程度，又有所下降(圖4)。一般來說，溶劑量越大，有效成分浸出越完全，提取率亦越大；但過大的料液比也會使雜質(zhì)大量浸出，不僅造成溶劑和能量的浪費，也給后續(xù)的濃縮工作增加困難[13]。綜合考慮，料液比宜在1:5～1:20之間選擇。

圖4 提取料液比對腰果梨抑菌效果的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on antibacterial activity of extract from cashew apple

2.3.4 提取時間的影響

圖5 提取時間對腰果梨抑菌效果的影響Fig.5 Effect of extraction time on antibacterial activity of extract from cashew apple

圖5 顯示，隨提取時間的延長，提取物抑菌效果增強的趨勢并不是很明顯。當(dāng)時間達(dá)1.5h左右時，抑菌圈直徑較大，抑菌效果較好，但時間繼續(xù)延長，抑菌圈直徑不再增加反而略微減小，提取物抑菌效果降低，其原因可能是抑菌成分在長時間的加熱過程中其抑菌活性被破壞。

2.3.5 提取pH值的影響

表4 腰果梨的中心組合設(shè)計方案及結(jié)果Table 4 Design and results of central composite experiments for optimizing the extraction of antibacterial materials from cashew apple

圖6 提取pH值對腰果梨抑菌效果的影響Fig. 6 Effect of extraction pH value on antibacterial activity of extract from cashew apple

由圖6可知：隨pH值降低，提取物抑菌圈直徑呈增大趨勢。但在pH1條件下，陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果，故不予考慮。通過Duncan比較發(fā)現(xiàn)：pH2與其他提取pH值之間均具有顯著性差異，所以選擇提取pH值為2。

2.4 腰果梨抑菌物質(zhì)提取工藝優(yōu)化

上述單因素試驗結(jié)果表明，溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比、提取時間等對腰果梨抑菌活性物質(zhì)的提取均具有不同程度的影響?？紤]到交互作用的影響，本研究以對金黃色葡萄球菌與白色念珠菌抑菌圈直徑之和為指標(biāo)，采用中心組合試驗設(shè)計法對腰果梨提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗結(jié)果見表4。

以黃色腰果梨為例，回歸分析如表5所示：當(dāng)P＜0.05 即表示該項指標(biāo)顯著，P＜0.01，則表明該指標(biāo)高度顯著[14]。由表5中P值可以知道，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，對結(jié)果的影響排序為：料液比＞提取溫度＞提取時間＞溶劑體積分?jǐn)?shù)。其中，X12、X22和X32對Y值(抑菌圈直徑之和)的影響極顯著，X2、X3和X42對Y值的影響顯著。可見，試驗因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，二次項對響應(yīng)值也有很大影響。響應(yīng)面分析所選的4個因素(溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比、提取時間)之間的交互效應(yīng)比較小，這一結(jié)論也可由響應(yīng)面分析圖得到。

表5 黃色腰果梨抑菌物質(zhì)提取的方差分析Table 5 Variance analysis of central composite experiments for optimizing the extraction of antibacterial materials from yellow cashew apple

由圖7可知：在所選腰果梨提取范圍內(nèi)存在極值，即響應(yīng)面最高點。腰果梨提取溫度過高，時間過長可導(dǎo)致抑菌效果呈緩慢下降趨勢，提取溫度在84～88℃附近出現(xiàn)峰值。在一定提取時間條件下，提高溶劑體積分?jǐn)?shù)可以使抑菌效果增強，但是體積分?jǐn)?shù)過高，反而會降低抑菌效果。溶劑的體積分?jǐn)?shù)在70%附近出現(xiàn)極值，這一結(jié)果與單因素試驗結(jié)果一致。溫度和時間、溫度和料液比以及體積分?jǐn)?shù)和時間之間的交互作用不大。料液比和提取溫度對響應(yīng)值影響較大，與方差分析的結(jié)果相吻合。

圖7 試驗因素交互作用的響應(yīng)面分析圖Fig.7 Response surface analysis plots for the effects of cross-interactions among factors on antibacterial activity of extracts from cashew apple

圖9 腰果梨提取優(yōu)化后的抑菌試驗研究Fig.9 Inhibitory effects of yellow and red cashew apple extracts using optimal extraction processing on test bacterial strains

LINGO語言分析所得到的最佳方案為：黃色腰果梨：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度85℃，料液比1:13.9，提取時間2.65h；紅色腰果梨：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度85℃，料液比1:14.5，提取時間2.44h。分別對最佳方案進(jìn)行實驗驗證，結(jié)果顯示提取物對金黃色葡萄球菌與白色念珠菌的抑菌圈直徑之和分別為25.2mm與26.2mm，與理論值的24.82mm和25.21mm相差不大，因此，該方法對腰果梨提取條件的優(yōu)化是可行的，具有實際應(yīng)用價值。

2.5 優(yōu)化后的提取物對供試菌的抑制效果

圖8 腰果梨提取工藝優(yōu)化后對供試菌的抑制作用Fig.8 Inhibitory effects of yellow and red cashew apple extracts using optimal extraction processing on test bacterial strains

如圖8所示：兩種不同顏色的腰果梨經(jīng)提取優(yōu)化后對供試菌的抑制作用均有不同程度的增強。與工藝優(yōu)化前相比，提取物對表皮葡萄球菌CBL-R、表皮葡萄球菌TS5、白色念珠菌、變形桿菌和大腸桿菌的抑菌效果提高較明顯。黃色腰果梨分別提高24.3%、8.4%、13.3%、25.3%和13.5%；紅色腰果梨分別提高27.8%、17.1%、19%、32.5%和10.5%。圖9為優(yōu)化提取條件后，紅、黃腰果梨提取物抑菌試驗的照片(以慶大霉素作陽性對照，空白提取液作陰性對照)。

以黃色腰果梨為例，將工藝優(yōu)化前后腰果梨的抑菌效果進(jìn)行差異分析(圖10)。Duncan比較發(fā)現(xiàn)：對表皮葡萄球菌CBL-R、表皮葡萄球菌TS5、白色念珠菌、變形桿菌和大腸桿菌的抑制作用較工藝優(yōu)化前均具有顯著性差異。證實了在抑菌效果方面，該提取工藝與優(yōu)化前相比得到了顯著性提高。

圖10 黃色腰果梨提取優(yōu)化前后抑菌效果的比較Fig.10 Comparison on inhibitory effects of yellow cashew apple extracts using non-optimal and optimal extraction processing on test bacterial strains

3 結(jié)論與討論

抑菌試驗結(jié)果表明，腰果梨對多種常見病原菌特別是口腔病原菌具有明顯的抑制作用，推測其含有多種抑菌活性物質(zhì)。先后通過單因素試驗、中心組合試驗設(shè)計法優(yōu)化了腰果梨抑菌活性物質(zhì)的提取工藝，獲得了最佳提取工藝參數(shù)。黃色腰果梨最佳提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度85℃，料液比1:13.9，提取時間2.65h；紅色腰果梨最佳提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度85℃，料液比1:14.5，提取時間2.44h。提取條件經(jīng)優(yōu)化后，腰果梨提取物對表皮葡萄球菌CBL-R、表皮葡萄球菌TS5、白色念珠菌、變形桿菌和大腸桿菌的抑菌效果明顯增強。黃色腰果梨分別提高24.3%、8.4%、13.3%、25.3%和13.5%；紅色腰果梨分別提高27.8%、17.1%、19%、32.5%和10.5%。

實驗選擇的表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、唾液鏈球菌等是人類口腔中常見的致病菌[15]。許多同類研究也已證實植物中的肽類、不飽和長鏈脂肪酸、醛、生物堿、揮發(fā)油、酚和水溶性或醇溶性化合物[16-18]對多種感染人類與動物的細(xì)菌、真菌和病毒具有顯著抑制作用，在治療實踐中具有重要意義。由此推測腰果梨酒對口腔炎癥的治療作用可能與腰果梨乙醇提取物的抑菌作用密切相關(guān)。

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Extraction of Antibacterial Materials from Cashew Apple

MIAO Zi-jian，LI Cong-fa，TANG Yan-ping，XIONG Hai-bo，HOU Yuan-yuan，LIU Si-xin*
(College of Food Science and Technology, Hainan University, Haikou 570228, China)

Antibacterial materials were extracted from cashew apple and the inhibitory effect of the extract on different test strains was evaluated. Single-factor and central composite experiments were used to explore the optimal extraction processing parameters for antibacterial materials from yellow and red cashew apple using Staphylococcus aureus and Candida albicans as the indicators. The optimal extraction processing parameters for antibacterial materials from yellow cashew apple were ethanol concentration of 70%, extraction temperature of 85 ℃, material-liquid ratio of 1:13.9 and extraction time of 2.65 h; while the optimal extraction processing parameters for antibacterial materials from red cashew apple were ethanol concentration of 70%, extraction temperature of 85 ℃, material-liquid ratio of 1:14.5 and extraction time of 2.44 h. The extract obtained by optimal extraction processing from cashew apple exhibited an enhanced inhibitory effect on test bacterial strains.

cashew apple；antibacterial activity；extraction；central composite design

TS201.1

A

1002-6630(2010)24-0001-07

2010-09-13

“十一五”國家科技支撐計劃課題(2007BAD76B04)；?？谑懈咝录夹g(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(?？屏2009])；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(200903026)

苗子健(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為應(yīng)用微生物技術(shù)。E-mail：miaozijian1100@sina.com

*通信作者：劉四新(1966—)，女，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：liusixin@21cn.com