羅舜菁，鐘寒燕，劉成梅，陳婷婷，陳發(fā)榮，嚴(yán)杰琳

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

氯霉素免疫抗原及包被抗原的制備

羅舜菁，鐘寒燕，劉成梅，陳婷婷，陳發(fā)榮，嚴(yán)杰琳

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

采用混合酸酐法合成30:1～10:1 三個(gè)不同起始物質(zhì)的量比的氯霉素免疫抗原(HAP-KLH)，采用活潑酯法(EDC-NHS)合成40:1～1:1 七個(gè)不同起始物質(zhì)的量比的包被抗原(HAP-OVA)，紫外測(cè)定HAP-KLH偶聯(lián)比25:1～8:1，HAP-OVA偶聯(lián)比23:1～1:3。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)優(yōu)化包被抗原，在23:1～3:1偶聯(lián)比范圍內(nèi)，氯霉素(CAP) IC50值為36～15ng/mL，隨著偶聯(lián)比的減小而降低，當(dāng)偶聯(lián)比低于3:1則略為上升。確定了包被抗原HAP-OVA最佳偶聯(lián)比為3:1。本研究表明包被抗原的偶聯(lián)比對(duì)ELISA測(cè)定IC50值有重要影響，應(yīng)合成不同偶聯(lián)比的包被抗原，選出最佳偶聯(lián)比。

氯霉素；免疫抗原；包被抗原；偶聯(lián)比

氯霉素(chloramphenicol，CAP)是一種廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌均有抑制作用[1]。氯霉素對(duì)人體有較強(qiáng)的副作用和毒性，可導(dǎo)致再生障礙性貧血和粒細(xì)胞缺乏癥[2]。2002年中國(guó)農(nóng)業(yè)部《動(dòng)物性食品獸藥殘留規(guī)定》中規(guī)定氯霉素在可食部分不得檢出，在出口的日常檢測(cè)中列為必檢項(xiàng)目。但由于其低廉的價(jià)格和穩(wěn)定的抗菌性，在畜牧業(yè)及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中違法使用的現(xiàn)象仍屢見不鮮[3]。

對(duì)氯霉素的檢測(cè)方法有微生物檢測(cè)法、色譜分析法、免疫檢測(cè)法[4]。微生物法靈敏度低；色譜分析法樣品前處理麻煩，費(fèi)用高；免疫分析法具有快速、靈敏度高、高通量的特點(diǎn)。其中免疫分析方法有傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析、膠體金免疫層析技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法及新的液態(tài)芯片技術(shù)[5](又稱懸浮陣列技術(shù))，這些檢測(cè)方法都是以抗原抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析方法。它們的檢測(cè)靈敏度都與單克隆抗體的特異性、親和力密切相關(guān)[6]，若欲制備高特異性、高親和力的單克隆抗體不僅需要優(yōu)質(zhì)的免疫抗原，而且篩選產(chǎn)單克隆抗體細(xì)胞株時(shí)所用包被抗原偶聯(lián)比直接影響單克隆抗體質(zhì)量的判斷。氯霉素是小分子物質(zhì)，屬于

半抗原，需要與大分子物質(zhì)偶聯(lián)合成人工抗原才具有免疫原性，人工抗原包括免疫抗原和包被抗原。CAP與琥珀酸酐反應(yīng)的產(chǎn)物是琥珀氯霉素(HAP)，它和CAP有相同的抗原決定簇，可利用HAP制備抗CAP單克隆抗體。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)合成牛血清白蛋白(BSA)為載體的HAP-BSA免疫抗原，并制備出抗氯霉素單克隆抗體(mAb)，但親和性未達(dá)到商品化要求(CAP的IC50值為2～5ng/mL)，已制備出的單克隆抗體則用來(lái)考察包被抗原偶聯(lián)比對(duì)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)的影響。為了得到更高親和力的mAb，重新合成新抗原免疫小鼠，文獻(xiàn)報(bào)道[7]鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白(KLH)對(duì)比于常用的牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)等具有更好的免疫原性，但由于價(jià)格昂貴，較少用來(lái)作為載體蛋白，且未見報(bào)道用于合成氯霉素免疫抗原。本研究采用混合酸酐法將HAP與KLH偶聯(lián)合成免疫抗原(HAP-KLH)，采用活潑酯(EDC-NHS)法將HAP與OVA偶聯(lián)合成檢測(cè)用包被抗原。按3個(gè)不同起始物質(zhì)的量比合成不同偶聯(lián)比的HAP-KLH免疫抗原，分別免疫。按7個(gè)不同起始物質(zhì)的量比合成7個(gè)不同偶聯(lián)比的HAP-OVA包被抗原?？贵w為同一抗體，包被抗原采用上述7個(gè)不同偶聯(lián)比的HAP-OVA，利用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ic-ELISA)分別測(cè)定對(duì)應(yīng)的IC50值，IC50值最低時(shí)對(duì)應(yīng)的包被抗原的偶聯(lián)比為最佳偶聯(lián)比，為抗CAP單克隆抗體的制備和靈敏度高的檢測(cè)方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯霉素(CAP)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC-HCl) BBI公司；琥珀氯霉素(HAP)、鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) Sigma公司；酶標(biāo)板 美國(guó)Corning公司；其余試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；Multiskan MK3酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 人工抗原的合成

1.3.1.1 混合酸酐法合成HAP-KLH

稱取一定量的HAP，溶于DMF和1,4-二氧六環(huán)混合液(按體積比1:1配制)中，通過稀釋使最終質(zhì)量濃度為12.01、8.58、5.15μg/mL，體積各1mL，分別編號(hào)①、②、③。分別加入三正丁胺10μL，冰浴條件下攪拌反應(yīng)10min，加入氯甲酸異丁酯7μL，室溫下攪拌反應(yīng)1h，此為A液；稱取7.3mg K LH蛋白，溶于3mL的 0.01mol/L PBS溶液中，調(diào)節(jié)pH8.5，平均分成3份，編號(hào)①、②、③，此為B液。冰浴攪拌下，將A分別逐滴加入到編號(hào)相同的B中，維持pH8.5，冰浴條件下攪拌反應(yīng)4h，反應(yīng)液裝入透析袋中，用pH7.4 PBS透析3 d，每天換液3次。透析后冷凍干燥備用。

1.3.1.2 EDC-NHS法合成HAP-OVA

稱取7.0mg HAP溶于0.01mol/L PBS溶液中，分別加入一定量的EDC-HCl和NHS，控制pH值在5.0左右，室溫避光振蕩活化15min。加入20mmol/L的β-巰基乙醇4μL淬滅未反應(yīng)的EDC-HCl。將其平均分成7組，對(duì)應(yīng)編號(hào)為①、②、③、④、⑤、⑥、⑦，按H A P與OVA的起始物質(zhì)的量比為40:1、30:1、20:1、10:1、7:1、4:1、1:1分別加入一定量OVA溶液，室溫反應(yīng)2h后，反應(yīng)液中加入10mmol/L鹽酸羥胺3μL淬滅未反應(yīng)的NHS。反應(yīng)液用pH7.4的0.01mol/L PBS透析3d，透析后冷凍干燥備用。

1.3.2 人工抗原的的鑒定

紫外掃描HAP-KLH、標(biāo)準(zhǔn)品KLH、OVA、HAP。

1.3.3 人工抗原偶聯(lián)比的測(cè)定

1.3.4 HAP-OVA的優(yōu)化

1.3.4.1 間接ELISA法確定HAP-OVA、抗體最佳工作濃度

包被：將7個(gè)偶聯(lián)比的包被抗原HAP-OVA分別倍比稀釋成一系列質(zhì)量濃度梯度10、5、2.5、1.25、

0.625、0.3125、0.1562μg/mL，加至酶標(biāo)板，同列為同一濃度，100μL/孔，4℃冰箱過夜。用PBST洗液洗5遍，吸水紙上拍干。封閉：每孔加380μL封閉液37℃封阻70min。洗滌同上。加抗體：抗體稀釋倍數(shù)從2×104到1.28×106作倍比稀釋。加入酶標(biāo)板中，同行七孔同濃度，37℃溫育1h，洗滌同上。加二抗：每孔加100μL HRP-羊抗兔IgG，37℃溫育1h，洗滌同上。顯色：每孔加100μL TMB顯色液，37℃溫育15min。終止：每孔加入50μL終止液，用酶標(biāo)儀讀取各孔OD450值。

以O(shè)D450值為1.0左右孔對(duì)應(yīng)的HAP-OVA包被濃度為抗原最佳工作濃度，此孔對(duì)應(yīng)的抗體濃度作為抗體最佳工作濃度。

1.3.4.2 ic-ELISA法測(cè)定CAP的IC50值

將7個(gè)偶聯(lián)比的HAP-OVA分別按1.3.4.1節(jié)確定的最佳濃度包板，進(jìn)行ic-ELISA實(shí)驗(yàn)，另配制一系列質(zhì)量濃度的CAP標(biāo)準(zhǔn)溶液(103、102、50、20、10、5、0ng/mL)，加入50μL CAP標(biāo)液和50μL最佳工作濃度的單抗，測(cè)定不同濃度CAP的抑制率，以抑制率B/B0(B是CAP不同標(biāo)準(zhǔn)濃度對(duì)應(yīng)的OD450值，B0是CAP濃度為0時(shí)OD450值)為縱坐標(biāo)，以不同濃度的CAP為橫坐標(biāo)繪制曲線，抑制率為50%對(duì)應(yīng)的CAP濃度為半數(shù)抑制濃度IC50值。整個(gè)ELISA實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原的鑒定結(jié)果

KLH、HAP、偶聯(lián)物HAP-KLH、標(biāo)準(zhǔn)品OVA、偶聯(lián)物HAP-OVA的紫外掃描見圖1。為與偶聯(lián)物透析環(huán)境相似，將KLH標(biāo)準(zhǔn)品溶于PBS溶液，在4℃放置3d后進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果見圖1a。KLH在200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)沒有明顯的特征吸收峰，吸光度隨波長(zhǎng)的減小一直呈增大趨勢(shì)。由圖1b可知，HAP特征吸收峰為276nm。由圖1c可知，HAP-KLH的吸收在276nm附近明顯有拐點(diǎn)，260～278nm處吸收度大致持平，對(duì)比圖1a可知，這一變化主要是偶聯(lián)物中HAP的影響，可以證明HAP-KLH偶聯(lián)成功。OVA、HAP、HAP-OVA的特征吸收峰分別在278、276、277nm，由此可判斷出HAP-OVA偶聯(lián)成功。

圖1 紫外掃描圖Fig.1 UV absorption spectra of KLH chloramphenicolsuccinate, a chloramphenicolsuccinate-KLH conjugate, OVA and a chloramphenicolsuccinate-OVA conjugate

2.2 免疫抗原偶聯(lián)比結(jié)果

免疫抗原HAP-KLH偶聯(lián)比結(jié)果見表1。相關(guān)研究[9]表明，免疫抗原的偶聯(lián)比太高會(huì)導(dǎo)致特異性不好，偶聯(lián)比太低則抗體產(chǎn)生的滴度不高，且根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，偶聯(lián)比在10:1～20:1為宜，過多的半抗原可能會(huì)影響載體蛋白與淋巴細(xì)胞表面的接觸致使免疫反應(yīng)減弱。不同人工抗原具有不同的最佳偶聯(lián)比，為了獲得最佳免疫效果，得到特異性最好和效價(jià)最高的單克隆抗體，應(yīng)制備不同偶聯(lián)比的免疫抗原免疫小鼠，并用不同的劑量免疫小鼠，低劑量較難刺激機(jī)體免疫，但一旦免疫成功則能得到更高親和力抗體。

表2 HAP-OVA偶聯(lián)比Table 2 Coupling ratios corresponding to initial molar ratios between chloramphenicolsuccinate and OVA

包被抗原偶聯(lián)比結(jié)果見表2。用不同的方法合成免疫抗原和包被抗原，可以避免合成免疫抗原時(shí)引入氯甲酸異丁酯部分基團(tuán)所造成的橋抗體的干擾[10]。采用活潑酯法合成了偶聯(lián)比23:1～1:3的包被抗原。

2.3 包被抗原優(yōu)化結(jié)果

表3 ic-ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of determination of IC50 of CAP by the ic-ELISA method

在ic-ELISA實(shí)驗(yàn)中，用不同偶聯(lián)比的HAP-OVA包板測(cè)得CAP的IC50值結(jié)果見表3。不同偶聯(lián)比的HAPOVA作為包被抗原進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)應(yīng)得到CAP的IC50值不一樣。CAP的IC50值越低，表明CAP對(duì)單抗與包被抗原結(jié)合的抑制作用越強(qiáng)，即抗體對(duì)待測(cè)小分子CAP的靈敏度越高。結(jié)果顯示，在26:1～3:1偶聯(lián)比范圍內(nèi)，CAP的IC50值為36～15ng/mL，隨著偶聯(lián)比的減小而降低，當(dāng)偶聯(lián)比為3:1～1:3，IC50值從15ng/mL略為上升至18ng/mL。一方面是因?yàn)榘豢乖悸?lián)比過高，偶聯(lián)在大分子OVA上的半抗原HAP相互擁擠，HAP的舒展性受到抑制，阻礙了HAP與抗體的結(jié)合，使使IC50值偏低；另一方面，半抗原HAP相互疊加所形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使加入的競(jìng)爭(zhēng)品CAP嵌入其中，影響CAP抗原表位的充分展露，導(dǎo)致實(shí)際和抗體結(jié)合的CAP量減少，要達(dá)到半數(shù)抑制所要加入的CAP量增大，這兩方面的作用，導(dǎo)致在一定范圍內(nèi)隨著包被抗原偶聯(lián)比增加IC50值則增大。當(dāng)偶聯(lián)比為1:1～1:3時(shí)，包被抗原的質(zhì)量濃度增大至1.25μg/mL，包被在酶標(biāo)板上的蛋白質(zhì)分子OVA形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)使待測(cè)小分子CAP嵌入其中，影響CAP與抗體的結(jié)合，IC50值略微上升。

3 結(jié) 論

采用混合酸酐法以KLH作為載體蛋白合成氯霉素免疫抗原，通過紫外光譜檢測(cè)證明偶聯(lián)成功。采用活潑酯法合成以O(shè)VA為載體的包被抗原，考察不同偶聯(lián)比對(duì)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)的影響。結(jié)果表明，對(duì)于同一抗體，不同偶聯(lián)比的包被抗原測(cè)得的IC50值不同。在單克隆抗體整個(gè)制備過程中，抗體親和力是否達(dá)到要求，ic-ELISA測(cè)定的IC50值為最主要的反應(yīng)指標(biāo)。IC50值越低，表明抗體親和力越好，抗體與待測(cè)小分子反應(yīng)越靈敏。如果包被抗原未優(yōu)化，測(cè)得的IC50值可能偏高，導(dǎo)致誤判所制備出的單克隆抗體不合格，所以優(yōu)化包被抗原，選出最適偶聯(lián)比的包被抗原對(duì)真實(shí)測(cè)定IC50值至關(guān)重要。在制備免疫抗原和包被抗原時(shí)，常常對(duì)免疫抗原進(jìn)行偶聯(lián)比的考慮，而忽略了制備一系列不同偶聯(lián)比的包被抗原，本研究表明了包被抗原的偶聯(lián)比對(duì)ELISA實(shí)驗(yàn)影響的重要性。

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Preparation of Chloramphenicol Immunogen and Coating Antigen

LUO Shun-jing，ZHONG Han-yan，LIU Cheng-mei，CHEN Ting-ting，CHEN Fa-rong，YAN Jie-lin
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Chloramphenicolsuccinate and keyhole limpet hemocyanin (KLH) were mixed at 3 initial molar ratios, namely 30:1, 20:1 and 10:1, to synthesize chloramphenicol (CAP) immunogens (hapten-KLH conjugates) with coupling ratios of 25:1, 16:1 and 8:1, respectively. Additionally, chloramphenicolsuccinate was mixed with ovalbumin (OVA) at 7 initial molar ratios, namely 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 7:1, 4:1 and 1:1, to synthesize CAP coating antigens (hapten-OVA conjugates) with coupling ratios determined by the UV spectrometric method of 23:1, 20:1, 14:1, 6:1, 3:1, 1:1 and 1:3, respectively. Indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay (ic-ELISA) experiments were carried out to choose a CAP coating antigen with an optimal coupling ratio. CAP was determined with the CAP coating antigens to have IC50 values ranging from 15 to 36 ng/mL. As the coupling ratio between chloramphenicolsuccinate and OVA decreased from 26:1 to 3:1, there was a decrease in the IC50 value of CAP. When the coupling ratio was less than 3:1, the IC50value of CAP exhibited a slight increase. These findings demonstrate that a CAP coating antigen with an optimal coupling ratio should be synthesized for the ic-ELISA assay of IC50significantly influenced by coupling ratio.

chloramphenicol；immunogen；coating antigen；coupling ratio

R446.61

A

1002-6630(2010)10-0091-04

2009-08-05

江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(GJJ09062)

羅舜菁(1969—)，女，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：luoshunjing@yahoo.com.cn