韓明遠(yuǎn),沈青春,張志剛,寧宜寶

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所農(nóng)業(yè)部獸用生物制品創(chuàng)制與評(píng)價(jià)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,北京 100081)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine rep roductive and respiratory syndrom e,PRRS)是豬群中流行的重要的傳染病之一,可引起母豬的繁殖障礙(包括流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等)、仔豬成活率急劇下降和育成豬呼吸道癥狀等。病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV),該病毒為單股正鏈RNA病毒,與馬動(dòng)脈炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)、鼠乳酸脫氫酶升高癥病毒(Lactate dehydrogenase elevating virus,LDV)及猴出血熱病毒(Simian hemorrhagic fever virus,SHFV)同屬于動(dòng)脈炎病毒屬[1]。

雖然PRRSV在感染豬脾臟、肝臟、派伊爾氏淋巴集結(jié)以及胸腺中均有發(fā)現(xiàn),但是PRRSV具有嚴(yán)格的細(xì)胞嗜性,在體內(nèi)主要感染豬肺巨噬細(xì)胞(porcine alveolarmacrophages,PAM)。其他細(xì)胞系如MA 104細(xì)胞、Marc-145細(xì)胞及CL2621細(xì)胞,多用于PRRSV體外增殖。與其他囊膜病毒感染細(xì)胞的過(guò)程相似,PRRSV需要首先與細(xì)胞受體結(jié)合,通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),在胞內(nèi)完成病毒的脫殼與基因組釋放。PRRSV侵入細(xì)胞的機(jī)制與影響因素被研究人員所關(guān)注,自1998年段小波發(fā)現(xiàn)第1個(gè)PRRSV受體以來(lái),多個(gè)PRRSV受體以及相關(guān)大分子物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)。到目前為止,包括細(xì)胞受體、胞內(nèi)大分子物質(zhì)和細(xì)胞因子在內(nèi)的多個(gè)因素被證明能夠影響PRRSV感染宿主細(xì)胞與在宿主細(xì)胞中增殖。

1 細(xì)胞受體

大多數(shù)病毒侵入宿主細(xì)胞首先要與細(xì)胞受體相互作用,使病毒富集于細(xì)胞表面,隨后細(xì)胞受體介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中或?qū)⑾嚓P(guān)信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)部使病毒完成與細(xì)胞膜的融合[2]。為了解釋PRRSV細(xì)胞嗜性的機(jī)制,人們一直在 PRRSV靶細(xì)胞中尋找PRRSV受體。K reutz LC[3]認(rèn)為PRRSV細(xì)胞嗜性的決定性因素在于宿主細(xì)胞膜上的相關(guān)因子。目前在PAM與Marc-145中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)PRRSV細(xì)胞受體,并且證明細(xì)胞受體在PRSSV進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程中所起十分重要的作用。

1.1 PAM 中的PRRSV受體

唾液酸黏附素(sialoadhesin,Sn)在許多情況下能夠幫助病原體感染宿主細(xì)胞。例如,能夠表達(dá)Sn的CD14+單核細(xì)胞能夠與人類免疫缺陷病毒(Hum an immunodeficiency virus,H IV)囊膜糖蛋白gp120上唾液酸殘基發(fā)生相互作用,從而介導(dǎo)H IV感染細(xì)胞。與H IV將Sn作為細(xì)胞受體所不同,人鼻病毒(Human rhinoviruses,H RV)通過(guò)誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(dend ritic cells,DC)表達(dá)Sn以抑制樹突狀細(xì)胞部分功能,從而在HRV感染機(jī)體后下調(diào)機(jī)體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答水平[4-5]。

Sn也能夠幫助PRRSV進(jìn)入靶細(xì)胞中,并且試驗(yàn)證實(shí)Sn是PRRSV的受體。段小波最早使用能夠阻斷PRRSV感染PAM的單克隆抗體M b41D3與PAM作用,通過(guò)免疫沉淀的方法在PAM中找到了一個(gè)分子質(zhì)量約為210 ku的細(xì)胞膜蛋白,并確定該蛋白為PRRSV受體。但該試驗(yàn)沒(méi)有對(duì)該蛋白作進(jìn)一步的分析,蛋白具體信息不明[6]。在隨后的研究中通過(guò)對(duì)該210 ku蛋白進(jìn)行胰蛋白酶消化,并對(duì)得到肽段用質(zhì)譜方法得到蛋白序列,隨后與蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)比對(duì)證明該210 ku蛋白為Sn[7]。雖然Sn能夠介導(dǎo)PRRSV進(jìn)入PAM,PRRSV也可以通過(guò)Sn非依賴性途徑感染宿主細(xì)胞,但該途徑只在特定細(xì)胞系中進(jìn)行[8]。

在發(fā)現(xiàn)肝素可以抑制PRRSV感染M arc-145細(xì)胞之后,Delputte P L等[9]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)PAM表面存在的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)能夠與PRRSV相互作用,隨后證實(shí)HS是PRRSV的受體,同時(shí)發(fā)現(xiàn)PRRSV中以M-GP5復(fù)合物形式存在的病毒基質(zhì)蛋白是HS受體的主要結(jié)合位點(diǎn)。

確定Sn和HS為PRRSV受體后,Delputte P L等[10]通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝素與m Ab41D3在共同作用下完全可以阻斷PRRSV感染PAM。他認(rèn)為只有這兩種受體參與PRRSV感染PAM的過(guò)程。根據(jù)后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果,Delputte P L認(rèn)為 PRRSV感染PAM的早期首先與HS進(jìn)行相互作用,使PRRSV在PAM的表面富集,進(jìn)而促進(jìn)PRRSV與Sn的相互作用,完成病毒的內(nèi)化。

雖然在上述兩種受體的作用下,PAM可以內(nèi)化PRRSV,但是PRRSV基因組并沒(méi)有在細(xì)胞質(zhì)中釋放,這說(shuō)明還需要某種因子幫助PRRSV釋放基因組,以使PRRSV在PAM中能夠引起增殖性感染[9]。

1.2 Marc-145細(xì)胞中的PRRSV受體

雖然Jusa E R等通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝素可以阻止PRRSV感染M arc-145細(xì)胞,但是 Kim JK等[11]認(rèn)為PAM中的PRRSV受體Sn與HS并不能夠在Marc-145細(xì)胞中表達(dá)。可見 PRRSV侵入 M arc-145細(xì)胞的途徑與豬肺巨噬細(xì)胞所采取的途徑截然不同。

Kim JK等[11]研究發(fā)現(xiàn)M arc-145細(xì)胞中的波形蛋白(vimentin)為PRRSV受體。波形蛋白為中間纖維的主要成分。中間纖維大致分為五類,分別為角蛋白纖維、波形纖維、結(jié)蛋白纖維、神經(jīng)元纖維和神經(jīng)膠質(zhì)纖維。微絲(m icrofilam ent,MF)、微管(m icrotubule)與中間纖維(intermediate filament,IF)構(gòu)成了細(xì)胞質(zhì)骨架體系。除了構(gòu)成細(xì)胞結(jié)構(gòu)之外,波形蛋白在外源病毒侵入宿主細(xì)胞的過(guò)程中也起到了重要作用。Kim JK在試驗(yàn)中使用能夠阻斷PRRSV感染 M arc-145細(xì)胞的單克隆抗體 7G10(7G10MAb)與M arc-145細(xì)胞作用后,通過(guò)二維電泳和質(zhì)譜分析的方法,發(fā)現(xiàn)與7G10MAb結(jié)合的蛋白復(fù)合物由7種蛋白構(gòu)成,而通過(guò)Western b lot發(fā)現(xiàn)只有波形蛋白能夠與7G10MAb直接結(jié)合。隨后證實(shí)PRRSV可與波形蛋白發(fā)生結(jié)合,當(dāng)將波形蛋白轉(zhuǎn)入PRRSV非受納細(xì)胞BHK之后,PRRSV可以感染該細(xì)胞,證明了波形蛋白為PRRSV的受體。同時(shí)該試驗(yàn)還證明M arc-145細(xì)胞的表面以及細(xì)胞質(zhì)中均存在波形蛋白,且MARC-145波形蛋白的表達(dá)受PRRSV的調(diào)控。值得注意的是波形蛋白是重要的磷蛋白,能被多種蛋白激酶磷酸化,磷酸化作用可能會(huì)影響到波形蛋白的性質(zhì)。例如磷酸化后的波形蛋白被高爾基體分泌到體外后會(huì)與病原發(fā)生作用,而波形蛋白的磷酸化可能與PRRSV嚴(yán)格的細(xì)胞嗜性有關(guān)。雖然波形蛋白被認(rèn)為是PRRSV受體,但沒(méi)有實(shí)驗(yàn)證明波形蛋白是否會(huì)引起病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖性感染[11]。

除了受體作用外,完整的細(xì)胞骨架對(duì)于PRRSV在M arc-145細(xì)胞之間傳播十分重要。當(dāng)能夠破壞完整細(xì)胞骨架的秋水仙素與細(xì)胞松弛素B共同作用于M arc-145細(xì)胞時(shí),PRRSV的感染率下降。通過(guò)實(shí)驗(yàn),Cafruny W A等[12]認(rèn)為PRRSV感染Marc-145細(xì)胞分為兩個(gè)過(guò)程,感染的初始階段只發(fā)生在特定范圍的細(xì)胞之中;在感染中后期,病毒由已感染細(xì)胞向未感染細(xì)胞進(jìn)行傳播。

1.3 Toll樣受體

Toll樣受體(toll like recep tor,TLR)在先天性免疫應(yīng)答中所起到十分重要的作用,通過(guò)與其他模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs)共同作用,對(duì)侵入機(jī)體病原微生物中存在的病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAM PS)進(jìn)行識(shí)別,繼而激活特定信號(hào)通路,使宿主細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)病原的防御作用。目前至少有10種TLR已經(jīng)在人類和小鼠中發(fā)現(xiàn)[13]。

宿主細(xì)胞可以利用多種PRRs對(duì)PAMPs進(jìn)行識(shí)別以誘導(dǎo)抗病毒應(yīng)答,其中最主要的就是TLR。TLR3、TLR7、TLR 8和 TLR 9似乎構(gòu)成了針對(duì)病毒病原相關(guān)分子模式的TLR亞群,其中TLR3識(shí)別病毒雙股RNA(dsRNA),TLR7和TLR8識(shí)別來(lái)源于病毒基因組的dsRNA片段,TLR9則是識(shí)別在細(xì)菌與病毒中都常見的CpG基序。TLR通過(guò)MyD88依賴性信號(hào)通路或M yD88非依賴性信號(hào)通路,調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平,從而完成對(duì)病毒的抑制作用[14]。

與Sn、Hs以及波形蛋白介導(dǎo)PRRSV感染靶細(xì)胞的作用不同,TLR3的表達(dá)能夠抑制PRRSV感染PAM與M arc-145細(xì)胞。在近期的研究中,能夠作為TLR3配體的 dsRNA Poly(I:C)被用于研究TLR3作用。這種人工合成dsRNA的使用能夠上調(diào)TLR3表達(dá),繼而促進(jìn)細(xì)胞IFN-r的合成,從而抑制PRRSV對(duì)細(xì)胞的感染[13]。

2 胞內(nèi)大分子物質(zhì)

雖然試驗(yàn)證明在PRRSV感染靶細(xì)胞的過(guò)程中PRRSV受體不可缺少,但是根據(jù)目前研究來(lái)看,PRRSV細(xì)胞受體只能幫助PRRSV通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中,而病毒脫殼與病毒基因組的釋放則需要在胞內(nèi)大分子的協(xié)同作用下完成。

2.1 CD163

CD163分子是清道夫受體(scavenger receptor,SR)蛋白家族的一員。SR蛋白包括大量位于細(xì)胞表面的可溶性糖蛋白,這些糖蛋白可與配體識(shí)別,從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答水平。Calvert JG等[8]通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)CD163分子在PRRSV感染M arc-145細(xì)胞的過(guò)程中起到了重要作用。將CD163在其他PRRSV非受納細(xì)胞中的表達(dá),能夠促進(jìn)PRRSV對(duì)這些細(xì)胞的感染,并產(chǎn)生病毒增殖能力。

PAM表面的CD163分子有助于PRRSV感染PAM。Van Gorp H等[15]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)CD163特異性單克隆抗體與巨噬細(xì)胞在37℃下孵育后,PRRSV感染宿主細(xì)胞的效率下降了75%。而將抗CD163與抗Sn的抗體共同與PAM細(xì)胞進(jìn)行孵育時(shí)可以完全阻斷PRRSV感染。通過(guò)共聚焦顯微鏡分析,PRRSV與僅表達(dá)Sn的細(xì)胞作用時(shí),只發(fā)生病毒顆粒的內(nèi)化,但是不會(huì)發(fā)生病毒顆粒的脫殼。當(dāng)PRRSV感染Sn與CD163共表達(dá)的細(xì)胞時(shí),病毒顆粒的內(nèi)化與病毒的脫殼同時(shí)發(fā)生,并且感染效率與單一表達(dá)CD 163的細(xì)胞相比要高10倍～100倍。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)Van Gorp H認(rèn)為,CD163能夠增加病毒感染宿主細(xì)胞的能力,但CD 163不是一個(gè)細(xì)胞受體,CD163只是介導(dǎo)PRRSV在細(xì)胞質(zhì)中脫殼,并將病毒基因組釋放。

綜上所述,PRRSV在感染PAM的過(guò)程如下:PRRSV的基質(zhì)蛋白(M蛋白)首先與PAM表面的HS發(fā)結(jié)合,使病毒顆在PAM表面富集。隨后病毒顆粒上的唾液酸與PAM表面Sn受體相互作用共同完成病毒顆粒的內(nèi)化。病毒內(nèi)化后被轉(zhuǎn)運(yùn)到PAM細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)胞質(zhì)中的pH低,而pH降低是病毒脫殼的必要條件。PRRSV在細(xì)胞內(nèi)CD163分子的協(xié)同作用下完成脫殼,將病毒的基因組釋放,使PRRSV在PAM中可以完成增殖性感染。

2.2 CD151

CD151也被認(rèn)為在PRRSV感染靶細(xì)胞的過(guò)程中起到了重要作用。表達(dá)CD151的BHK細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)PRRSV增殖性感染。同時(shí)對(duì)M arc-145細(xì)胞中的CD151的基因進(jìn)行siRNA干擾,可抑制PRRSV感染M arc-145細(xì)胞的水平。CD151提升 PRRSV感染M arc-145細(xì)胞的能力主要是由于PRRSV 3′端非轉(zhuǎn)錄區(qū)(3′UTR)與CD151的發(fā)生結(jié)合導(dǎo)致[16]。

3 細(xì)胞因子的作用

3.1 干擾素對(duì)于PRRSV感染的影響

干擾素(interferon,IFN)在先天性免疫應(yīng)答中所起十分重要的作用。干擾素分為Ⅰ型和Ⅱ型兩種,其中Ⅰ型干擾素包括IFN-α、IFN-β,Ⅱ型干擾素為IFN-γ。通過(guò)調(diào)控?cái)?shù)百種基因的轉(zhuǎn)錄水平,IFN誘導(dǎo)產(chǎn)生具有抗病毒作用的蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)包括蛋白質(zhì)激酶(protein kinase,PKR)、2′,5′-寡腺苷酸合成酶(2′,5′-oligadeny late synthetase,OAS)和核糖核酸酶L(RNase L)、RNA特異性腺苷脫氨基酶(RNA-specific adenosine deaminase,ADAR)和M x蛋白。

PRRSV侵入機(jī)體之后,最初的免疫應(yīng)答發(fā)生在被感染巨噬細(xì)胞中。在這些細(xì)胞中出現(xiàn)的dsRNA在胞內(nèi)會(huì)引起一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng),一般是以Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生為標(biāo)志。IFN-α能夠抑制病毒在靶細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制,這主要是通過(guò)M x1蛋白起到抗病毒作用[17]。不同毒株對(duì)于IFN-α的敏感性不同,且誘導(dǎo)PAM產(chǎn)生IFN-α的能力也存在差異[18]。重組IFN-β可以抑制PRSSV感染PAM與Marc-145細(xì)胞[19]。值得注意的是PRRSV會(huì)抑制 IFN-a的分泌。PRRSV感染M arc-145細(xì)胞后,也不會(huì)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素[20-21]。

雖然IFN-α具有抗病毒作用,但是Delputte P L等[22]認(rèn)為使用IFN-α治療會(huì)上調(diào)單核細(xì)胞中Sn表達(dá),從而促進(jìn)PRRSV感染單核細(xì)胞的能力。

PRRSV感染機(jī)體之后,血清中存在 IFN-γ,而在外周血單核細(xì)胞(PBMCs)、肺以及淋巴結(jié)中均發(fā)現(xiàn)了IFN-γ的mRNA[23]。雖然PRRSV在感染機(jī)體之后T細(xì)胞介導(dǎo)的IFN-γ應(yīng)答水平逐漸升高,但是整體水平較為微弱[24]。IFN-γ既能夠抑制PRRSV在PAM中的復(fù)制也可以阻斷PRRSV在Marc-145細(xì)胞中的增殖。但是使用雙股RNA誘導(dǎo)蛋白激酶的抑制劑 2-氨基嘌呤之后可以恢復(fù)PRRSV在M arc-145細(xì)胞中的增殖情況,說(shuō)明IFNγ主要通過(guò)PKR途徑抑制病毒增殖[12]。

3.2 IL-12

IL-12是促進(jìn)細(xì)胞免疫、誘導(dǎo)T細(xì)胞以及NK細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ重要物質(zhì)。有報(bào)道稱重組的IL-12能夠介導(dǎo)PAM 產(chǎn)生IFN-γ,體外使用IL-12可以降低PAM中PRRSV的病毒滴度。IL-12已被用作PRRSV滅活疫苗與DNA疫苗的佐劑[25]。

4 小結(jié)

根據(jù)目前的相關(guān)報(bào)道,宿主細(xì)胞受體、胞內(nèi)大分子物質(zhì)以及細(xì)胞因子都會(huì)影響PRRSV感染宿主細(xì)胞與在宿主細(xì)胞增殖的過(guò)程。與多數(shù)病毒侵入細(xì)胞的過(guò)程相似,PRRSV在感染宿主細(xì)胞過(guò)程中需要細(xì)胞受體完成病毒顆粒在宿主細(xì)胞表面的富集與內(nèi)化過(guò)程,這對(duì)于 PRRSV的進(jìn)入宿主細(xì)胞十分重要。同時(shí),胞內(nèi)大分子物質(zhì)在病毒脫殼以及病毒遺傳物質(zhì)釋放過(guò)程中的發(fā)揮重要作用,目前的研究發(fā)現(xiàn)只有CD163和CD151分子涉及該過(guò)程。細(xì)胞因子對(duì)于PRRSV感染宿主細(xì)胞的抑制作用雖然不具有特異性,但是其作用不可忽視,部分研究中已經(jīng)將細(xì)胞因子做為PRRSV疫苗佐劑使用以提升疫苗的效力。

目前用于研究影響病毒感染與增殖因素的技術(shù)較為成熟,但是仍存在一些問(wèn)題制約相關(guān)研究。獲取特異性的單克隆抗體對(duì)于細(xì)胞受體的發(fā)現(xiàn)十分重要,所有的PRRSV受體的發(fā)現(xiàn)都是通過(guò)單克隆抗體與細(xì)胞受體的特異性反應(yīng)。同時(shí),大分子物質(zhì)的胞內(nèi)定位技術(shù)也十分重要,雖然研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩種大分子物質(zhì)參與了PRRSV感染與增殖的過(guò)程,但是這兩種大分子物質(zhì)在胞內(nèi)的具體位置需要通過(guò)定位技術(shù)確定,從而能夠系統(tǒng)地了解病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的整個(gè)過(guò)程。除了技術(shù)層面之外,基礎(chǔ)研究整體水平的上升對(duì)于進(jìn)一步研究影響PRRSV感染與增殖的因素十分關(guān)鍵。

研究影響PRRSV感染與增殖的因素,就預(yù)防與合理利用PRRSV而言十分關(guān)鍵。由于PRRSV感染機(jī)體初期,對(duì)PRRSV的抑制主要依賴于機(jī)體的抗病毒能力以及先天性免疫應(yīng)答水平,在此時(shí)期通過(guò)抑制、阻斷使PRRSV進(jìn)入機(jī)體的因素或許會(huì)有效抑制病毒感染宿主。例如可以使用單克隆抗體封閉宿主細(xì)胞表面的PRRSV受體,使PRRSV無(wú)法與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合,從而病毒無(wú)法在宿主細(xì)胞表面完成富集與內(nèi)化,以達(dá)到抑制PRRSV感染宿主細(xì)胞的目的。此外,PRRSV感染宿主具有持續(xù)性的特點(diǎn),利用PRRSV感染的持續(xù)性將PRRSV改造成表達(dá)載體的研究較多,通過(guò)在表達(dá)系統(tǒng)中添加促進(jìn)PRRSV感染的因素,可以改善PRRSV在宿主細(xì)胞的增殖狀況,以提高目的蛋白的表達(dá)量。根據(jù)目前的研究,通過(guò)在表達(dá)系統(tǒng)中加入胞內(nèi)大分子物質(zhì)或者共表達(dá)該類大分子物質(zhì),可使PRRSV產(chǎn)生增殖性感染,實(shí)現(xiàn)提高蛋白表達(dá)產(chǎn)量的目的。

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