趙澤坤,王 嬌,王金鳳,張嶺嶺,孫繼國(guó)

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河北保定071001)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),又稱(chēng)“豬藍(lán)耳病”,主要以引起母豬的繁殖障礙以及呼吸道的癥狀為特征,由于PRRSV與其他引起豬繁殖障礙的疾病等引起的臨床癥狀相似難以區(qū)分,并且由于其他細(xì)菌性疾病和病毒性疾病的繼發(fā)感染,使得臨床診斷更加困難,因此很難對(duì)該病做出準(zhǔn)確診斷,必須進(jìn)行病毒分離、免疫學(xué)檢測(cè)以及運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)綜合診斷才能確診。

1 病毒分離

病毒分離是PRRS最為確切的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。病毒分離最好采用死胎或弱仔豬的肺、腦、脾、血漿、血清等組織勻漿的混合物,經(jīng)處理后接種于適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)物。目前用于分離PRRSV的細(xì)胞有以下兒種:豬原代PAM,CL-2621,細(xì)胞克隆株Marc-145細(xì)胞最后又從Marc-145中克隆出更敏感的HS2H細(xì)胞用于PRRSV的分離。

PRRS發(fā)病急性期出現(xiàn)病毒血癥,因此,急性期采樣時(shí),分離成功率較高。另外,與成年豬相比,仔豬及死胎更適宜于采樣分離。但不同分離株在細(xì)胞培養(yǎng)上生長(zhǎng)繁殖的情況各不相同,有些毒株在每一代細(xì)胞培養(yǎng)3 d～4 d即可出現(xiàn)CPE,但有些毒株則需在第3代或4代才出現(xiàn)CPE,有些分離株在敏感細(xì)胞上并不出現(xiàn)細(xì)胞病變。因此,在進(jìn)行病毒分離的同時(shí),還應(yīng)結(jié)合相應(yīng)的IFA和IPMA等方法進(jìn)行鑒定。另外,還可用PCR法增殖病毒抗原,作遺傳基因鑒定,從而使結(jié)果更為可靠[1]。

2 抗原檢測(cè)

對(duì)PRRSV抗原的檢測(cè)一般建立在特異性單抗的基礎(chǔ)上,用全病毒抗原或多肽表達(dá)產(chǎn)物作為免疫原,已分別獲得PRRSV N,M,GP5,GP4,GP3蛋白的特異性單抗,其中N蛋白的免疫原性最強(qiáng),用全病毒免疫所獲得的單抗多半是針對(duì)N蛋白上的抗原表位。這些單抗中有些是針對(duì)美洲型和歐洲型毒株上共同的保守性抗原位點(diǎn),有些僅與美洲型或歐洲型毒株中的一型發(fā)生反應(yīng),合理地利用這些單抗進(jìn)行檢測(cè),可以同時(shí)檢出美洲型和歐洲型PRRSV,也可區(qū)分其血清型。檢測(cè)抗原的方法主要包括免疫熒光染色法、免疫過(guò)氧化物酶染色法,以及免疫膠體金技術(shù)。由于豬感染PRRSV后血清抗體可長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)存在,且抗原檢測(cè)時(shí)病料組織的處理較為繁瑣,因此,血清學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)抗體更適宜于PRRS的疾病監(jiān)測(cè)和診斷。

3 血清學(xué)方法

PRRS診斷的血清學(xué)方法也是目前診斷該病最為廣泛的方法。目前可用于檢測(cè)PRRS的血清學(xué)方法主要有間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA)、免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)、血清中和實(shí)驗(yàn)(SN)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)((ELISA)等四種。

3.1 免疫過(guò)氧化物酶細(xì)胞單層試驗(yàn)(IPMA)

IPMA具有較好的特異性和敏感性,是歐洲國(guó)家廣泛使用的血清學(xué)診斷方法,在美洲和亞洲國(guó)家也較為常用。可用本試驗(yàn)檢測(cè)病豬和康復(fù)后豬的雙份血清中的LV抗體。這種方法特異性強(qiáng),可測(cè)出感染后1周～2周至12個(gè)月的抗體,抗體效價(jià)低于100為陰性。試驗(yàn)主要在PAM,Marc-145,CL-2621細(xì)胞來(lái)進(jìn)行,此方法特異性與敏感性較好,可以用于PRRSV的抗原檢測(cè)、病毒的鑒定、血清抗體的檢測(cè)。該法能在感染后6日血清中檢測(cè)到抗體,但本方法需要專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗(yàn)設(shè)施,并且容易出現(xiàn)假陽(yáng)性,主觀性較強(qiáng)。

3.2 間接熒光抗體試驗(yàn)(IFA)

IFA是美國(guó)、加拿人、日本等國(guó)廣為應(yīng)用的血清學(xué)檢測(cè)方法,敏感性和特異性與IPMA相當(dāng),抗原制備也與IPMA法相同。IFA可檢測(cè)出感染后2 d～28 d的IgM抗體,血清抗體效價(jià)低于1∶20者為陰性。Joo H S等[2]用間接熒光抗體試驗(yàn)檢測(cè)了接種不同PRRSV毒株豬的IgG和IgM抗體反應(yīng),發(fā)現(xiàn)攜帶有IgM抗體的豬此前不久很可能受到PRRSV的感染。我國(guó)于1996年由哈爾濱獸醫(yī)研究所建立了1FA檢測(cè)方法。尹訓(xùn)南等[3]應(yīng)用IFA技術(shù)對(duì)人工感染PRRSV的3日齡～30日齡健康和/或SPF仔豬體內(nèi)病毒抗原或核酸的分布進(jìn)行研究,從臟器的血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管內(nèi)和巨噬細(xì)胞內(nèi)檢出了病毒抗原和核酸,此法的特異性與敏感性較好。但是,同IPMA一樣,這兩種方法的結(jié)果判斷帶有一定的主觀性,且不適于大規(guī)模臨床樣品的檢測(cè)。

3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

ELISA適宜于大規(guī)模檢測(cè),方便易行,操作過(guò)程及結(jié)果判斷能夠標(biāo)準(zhǔn)化,且具有高度的特異性和敏感性,目前許多國(guó)家已把ELISA作為監(jiān)測(cè)診斷的常規(guī)手段。另外,血清中PRRSV的ELISA抗體出現(xiàn)時(shí)間與IPMA和IFA抗體相當(dāng),但血清中PRRSV的ELISA抗體的持續(xù)時(shí)間明顯長(zhǎng)于IPMA和IFA抗體的持續(xù)時(shí)間。ELISA可測(cè)定感染后2周病毒抗體,當(dāng)OD值大于或等于0.4時(shí)可判為陽(yáng)性。

ELISA方法敏感、特異,比IPMA方法能更早的檢測(cè)出抗體。間接ELISA主要用于檢測(cè)血清中抗體,如PRRSV抗體,也可檢測(cè)抗原。Srensen K等[4]分別用3種方法(阻斷ELISA、間接ELISA,IPMA)檢測(cè)PRRSV抗體,結(jié)果發(fā)現(xiàn)阻斷ELISA的敏感性和特異性最高,與另外兩種方法相比,它成本較低,更易于大面積推廣。競(jìng)爭(zhēng)性ELISA可檢測(cè)抗體,Dea S等[5]成功地用該法檢測(cè)出了PRRSV核衣殼蛋白的抗體。王剛等[6]用差速離心法提純PRRSV利用NC膜作為載體,成功地建立了檢測(cè)PRRSV抗體的Dot-ELISA。

用于ELISA的抗原有兩種,一種是從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化的全病毒抗原,一種是重組的PRRSV核衣殼蛋白。因?yàn)镸arc-145細(xì)胞抗原成分容易引起非特異性反應(yīng),所以待檢的血清樣品必須同時(shí)對(duì)正常的細(xì)胞抗原進(jìn)行平行檢測(cè)作為對(duì)照。

3.4 血清中和試驗(yàn)(SN)

本法主要用于檢測(cè)PRRSV抗體,使用MARC-145細(xì)胞在96孔微量板上進(jìn)行。傳統(tǒng)的NT試驗(yàn)不能檢出急性感染期的抗體,并且需用雙份血清。Yoon和Takikawa等在血清和病毒混合液中加入補(bǔ)體,提高了反應(yīng)的敏感性,可在PRRSV感染早期作出診斷[7]這種改良后的方法最早在接種后8 d即能檢出NT抗體。接種11 d～21 d和41 d～45 d抗體效價(jià)較高。

4 分子生物學(xué)診斷

與血清學(xué)診斷方法相比,分子生物學(xué)診斷方法具有更高的特異性和敏感性。其方法主要包括核酸探針原位雜交技術(shù)(ISH)和RT-PCR技術(shù)。

4.1 原位雜交技術(shù)(ISH)

進(jìn)行原位雜交的cDNA探針主要是針對(duì)PRRSV的ORF7設(shè)計(jì)的。ISH用于PRRSV的檢測(cè),其敏感性高于免疫組化法和免疫膠體金技術(shù),而且檢出的持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng),因?yàn)镻RRSV RNA在組織中的存在時(shí)間較其抗原的表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)。另外,根據(jù)美洲型和歐洲型PRRSV的核酸序列設(shè)計(jì)合成不同的探針可區(qū)別不同基因型PRRSV的感染,而將兩種探針棍合后進(jìn)行ISH,則兩種基因型的感染均可檢出。該方法可以在肺、淋巴結(jié)、肺泡巨噬細(xì)胞等組織感染細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到PRRSV的RNA。

4.2 RT-PCR技術(shù)

RT-PCR法PCR為80年代中期發(fā)展的一種針對(duì)微生物核苷酸新的特異性診斷技術(shù),因具有較高的特異性和敏感性,己廣泛應(yīng)用病毒病診斷。RTPCR法不僅能診斷PRRSV,而且能進(jìn)行不同分離株的基因鑒定。據(jù)報(bào)道,RT-PCR技術(shù)能檢測(cè)出10—5TCID50病毒,故在診斷PRRS的工作中受到越來(lái)越多人歡迎。國(guó)外Christoph E等[8]建立了TaqMan RT-PCR法,對(duì)美洲毒株和歐洲毒株混合感染的群豬進(jìn)行鑒別診斷。Wesley R D等[9]對(duì)ORF5的RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行RFLP分析時(shí)可以區(qū)分疫苗株和野毒株。

針對(duì)2006年以來(lái)在我國(guó)發(fā)生的高致病性豬藍(lán)耳病,田克恭等首先建立了專(zhuān)門(mén)針對(duì)H-PRRSV的特異性RT-PCR方法。該方法具有良好的特異性,敏感性可達(dá)到4TCID50,該方法已申請(qǐng)專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?200710086548.2)。目前已有各種不同的針對(duì)高致病性PRRSV的RT-PCR方法,隨著技術(shù)的發(fā)展,新建立的RT-PCR、多重PCR、RTPCR-RFLP對(duì)診斷PRRSV的特異性更強(qiáng),敏感性更高。不僅可用于檢測(cè)各種臨床樣品,還可以鑒別不同基因型的毒株,區(qū)分疫苗株和野毒株。因此,RT-PCR方法無(wú)疑是一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的診斷方法。

5 小結(jié)

今年來(lái),PRRS對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害越來(lái)越嚴(yán)重,由于PRRSV不同分離株尤其是不同基因型(群)分離株在毒力、生物學(xué)特性、抗原性和遺傳特性上存在一定差異,利用單一PRRSV毒株制備的疫苗并不能完全保護(hù)免疫豬免受異源毒株的感染,因此,對(duì)PRRSV的早期的診斷至關(guān)重要。

雖然現(xiàn)在已有各種不同的檢測(cè)技術(shù),但是由于在臨床應(yīng)用上有著各種缺陷和局限性,并且隨著時(shí)代的進(jìn)步,對(duì)PRRSV診斷方法的先進(jìn)性、靈敏度、特異性有更高的要求,建立特異、敏感、簡(jiǎn)便、快速的診斷檢測(cè)技術(shù)仍是PRRSV研究的一個(gè)重要方向。

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