郝 磊綜述，陳幸華審校

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院血液科，重慶 400037)

異基因造血干細(xì)胞移植是目前治療血液系統(tǒng)惡性疾病的有效方法。以前認(rèn)為其成功機制在于移植前后的化療或放療對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。目前一致認(rèn)為，供體T細(xì)胞可以誘導(dǎo)殺死惡性細(xì)胞，即移植物抗白血病反應(yīng)(GV L)，是異基因造血干細(xì)胞移植成功治療血液系統(tǒng)惡性疾病的關(guān)鍵所在。但是，供體淋巴細(xì)胞在殺死受體惡性細(xì)胞的同時，可以識別受體細(xì)胞表面的主要組織相容性抗原和次要組織相容性抗原，損害受體正常組織，即移植物抗宿主病(GVHD)。GVHD是導(dǎo)致異基因造血干細(xì)胞移植患者發(fā)病和病死的主要原因，成為阻礙移植成功的關(guān)鍵因素。

理論上，尋找與受體人白細(xì)胞抗原(HLA)配型相合的供體是預(yù)防GVH D發(fā)生的根本措施，然而即使HLA相合的同胞供體移植，也會因受體次要組織相容性抗原的識別導(dǎo)致GVHD的發(fā)生。當(dāng)前，GVHD的預(yù)防性治療包括移植物T細(xì)胞去除(TCD)和免疫抑制劑的應(yīng)用。免疫抑制劑具有強烈的不良反應(yīng)，TCD顯著降低了供體T細(xì)胞的有利作用如增強植入、控制機會性感染和抗腫瘤效應(yīng)。這些措施的應(yīng)用在控制GVHD的同時，也削弱了GVL效應(yīng)，使惡性腫瘤復(fù)發(fā)率增高。GVHD和GVL效應(yīng)的有效分離是異基因造血干細(xì)胞移植需要解決的關(guān)鍵問題，成為醫(yī)學(xué)研究的焦點。本文對GVHD的發(fā)生、發(fā)展以及目前有望解決這一難題的細(xì)胞治療進(jìn)行綜述。

1 GVHD的發(fā)生機制

發(fā)主GVH D的3個條件:(1)移植物必須是有免疫活性的細(xì)胞;(2)移植物供者缺少宿主帶有的同種杭原;(3)宿主不對移植物產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)。GVHD的發(fā)生、發(fā)展主要分為3個階段:(1)造血干細(xì)胞移植前的預(yù)處理包括化療和放療，雖然可以最大程度地殺滅宿主體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，但同時造成其他組織如胃腸道、肝臟等的損傷，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子 TNF-α、IL-1、IL-6等大量釋放。這些細(xì)胞因子增強宿主主要組織相容性復(fù)合體抗原(M HC)、黏附分子以及趨化因子的表達(dá)，還可以提高供者T細(xì)胞異源反應(yīng)性的敏感度。經(jīng)損傷的胃腸道進(jìn)入機體的細(xì)菌脂多糖(LPS)進(jìn)一步加重了炎性細(xì)胞因子的釋放。(2)在宿主抗原提呈細(xì)胞(APC)或非 APC直接提呈以及供體APC的間接提呈抗原的作用下，供者的 T細(xì)胞表面受體(TC R)識別APC表面的M HC-抗原肽分子后發(fā)生交聯(lián)(第一信號)，同時APC表面共刺激分子如CD80和CD86等和T細(xì)胞表面CD28分子結(jié)合(第二信號)，在雙信號的刺激作用下，T細(xì)胞激活、增殖、分化為效應(yīng) T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞。(3)表達(dá)組織特異性黏附分子和趨化因子受體的抗原特異性T細(xì)胞遷移至表達(dá)多種黏附分子和趨化因子的外周組織，即GVHD的靶器官如皮膚、胃腸道和肝臟等。Th1型細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子不僅誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CT L)和NK細(xì)胞的激活，還進(jìn)一步激活單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，增強炎性細(xì)胞因子的再次釋放，同時一氧化氮(NO)的釋放也增加。因此，除了CTL和NK細(xì)胞介導(dǎo)的Fas/FasL途徑和穿孔素/顆粒酶途徑對GVHD靶器官造成直接損傷外，非特異性炎性細(xì)胞因子也促進(jìn)了器官特異性病理變化。

2 基因多態(tài)性和GVHD

對于相關(guān)和無關(guān)異基因造血干細(xì)胞移植，GVHD的發(fā)生主要與HLA不合有關(guān)。一項最大的關(guān)于供受體之間HLA相合的分析表明:HLA-A、HLA-B、HLA-C和 DRB1不相合時，病死率顯著增加[1]。除了已經(jīng)確認(rèn)的HLA-A和HLA-B不相合可以導(dǎo)致GVHD以外，臨床數(shù)據(jù)表明，不同 HLA-C和HLA-B等位基因，因表達(dá)異源反應(yīng)性NK細(xì)胞表面KIR抑制性受體的配體，參與單倍同一性無關(guān)HSCT的GVHD和GVL效應(yīng)，KIR配體不相合時，特別是急性髓細(xì)胞性白血病，GVHD的發(fā)生率降低，總體生存率提高。雖然HLA完全相合是成功移植的最佳條件，但是大多數(shù)患者無法得到配型完全相合的供體，識別可允許不合的特異性H LA等位基因，將有利于多數(shù)需要異基因造血干細(xì)胞移植的患者。

盡管采用高分辨率HLA分型，急性GVHD仍然是HLA相合異基因造血干細(xì)胞移植病死率的主要原因。此時，供體T細(xì)胞識別與之有差異的宿主次要組織相容性抗原(m HAg)，m HAgs是與主要組織相容性復(fù)合物結(jié)合的多態(tài)性肽，來源于細(xì)胞內(nèi)蛋白，可以普遍表達(dá)或造血系統(tǒng)限制性表達(dá)。移植前、后大量細(xì)胞因子合成，即“細(xì)胞因子風(fēng)暴”。大多數(shù)細(xì)胞因子基因包含遺傳性多態(tài)性，多態(tài)性是一些短核苷酸序列，呈現(xiàn)可變數(shù)量的重復(fù)(可變數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)或微衛(wèi)星)或單個核苷酸多態(tài)性。位于基因啟動子轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點，改變基因轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)炎性刺激導(dǎo)致的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此，健康人群中存在細(xì)胞因子表達(dá)量的差異。研究最早的是TNF和IL-10基因多態(tài)性與發(fā)生急性GVHD危險和嚴(yán)重度之間的關(guān)系[2]。TNF是急性GVHD過程中上調(diào)的重要細(xì)胞因子，IL-10拮抗TNF的釋放及功能。在HLA相合的異基因造血干細(xì)胞移植中，推測高表達(dá)人群濃度增高的TNF-α促進(jìn)了GVHD的發(fā)生，由于IL-10的低表達(dá)，不能完全下調(diào)GVHD反應(yīng)。許多研究表明關(guān)于TNF和IL-10基因多態(tài)性以及受體基因和GVHD的關(guān)系具有生物學(xué)意義。與GVHD相關(guān)的其他細(xì)胞因子基因多態(tài)性包括IL-6基因啟動子功能多態(tài)性、IFN-γ內(nèi)含子微衛(wèi)星多態(tài)性以及IL-1基因家族多態(tài)性。

已經(jīng)證實其他非 HLA編碼的基因如維菌藥物D受體(VDR)和雌激素受體(ER)對急性GVHD的發(fā)展也會產(chǎn)生影響，VDR內(nèi)含子8區(qū)和ER內(nèi)含子1區(qū)的多態(tài)性與GVHD的發(fā)生以及異基因造血干細(xì)胞移植后患者總體生存有關(guān)。

3 細(xì)胞治療和GVHD

3.1 間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC) Friedenstein等首次報道在骨髓基質(zhì)中存在干細(xì)胞，隨后很多研究證實采用Friedenstein的方法分離得到的M SC可以向成骨、成軟骨、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞分化。MSC缺乏特異性表面標(biāo)記，不表達(dá) CD45、CD34和 CD31等造血和內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記。據(jù)估計，其占骨髓有核細(xì)胞數(shù)的0.01%～0.001%。人MSC與胸腺上皮有共同的表面標(biāo)志，它們表達(dá)與T細(xì)胞相互作用的黏附分子包括有 VCAM-1、ICAM-1及LFA-3，推測MSC可能對T細(xì)胞發(fā)育及免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮作用。

很多動物實驗和臨床研究都證實異基因造血干細(xì)胞移植時同時輸注供體或第三者來源的MSC可以降低GVHD的發(fā)生率及嚴(yán)重程度。Gurevitch等的研究發(fā)現(xiàn)BALB小鼠在接受B6小鼠骨髓移植時，同時植入包括供鼠MSC在內(nèi)的骨髓塊，其發(fā)生GVHD的危險度與沒有接受移植的對照組相比顯著降低。患急性淋巴細(xì)胞白血病的9歲男孩，進(jìn)行骨髓移植后70 d出現(xiàn)Ⅳ度急性GVH D，免疫抑制劑無效，73 d時靜脈輸注其母親骨髓來源MSC(2×106個/kg)，220 d時GVHD的癥狀完全消失，患者出院[3]。Lazarus[4]的臨床研究發(fā)現(xiàn)，46例患血液惡性疾病的患者行骨髓或外周血干細(xì)胞移植的同時，移植體外培養(yǎng)的MSC，13例患者(28%)出現(xiàn)Ⅱ～ Ⅳ度急性 GVHD，無病生存率達(dá)到53%。然而在最大的2項前瞻性研究中，Ⅱ～Ⅳ度和Ⅲ～Ⅳ度急性GVHD的發(fā)生率分別為44%～64%和12%～26%。深入證實MSC的有利作用有待進(jìn)一步的隨機試驗。

輸注外源性MSC可以降低GVHD的發(fā)生率，其機制可能在于MSC對免疫細(xì)胞的抑制作用，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和APC。MSC分泌或免疫細(xì)胞受MSC刺激而分泌的一些可溶性分子包括肝細(xì)胞生長因子(HGF)、前列腺素 E2(PGE2)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、吲哚胺 2，3 二氧酶(IDO)、NO和IL-10等參與了體外MSC的抑制作用[5-7]。最新研究還發(fā)現(xiàn)MSC分泌的HLA-G5是其發(fā)揮抑制作用所必需的[8]。根據(jù)MSC接受的刺激不同，比如異源性決定子、膜蛋白、有絲分裂劑或細(xì)胞因子等，分泌的可溶性分子也不同。細(xì)胞接觸方式也可能參與了抑制，如 MSC表面B7H1的表達(dá)[9]。

3.2 NK細(xì)胞 NK細(xì)胞是骨髓來源的大顆粒淋巴細(xì)胞，約占人外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)的5%。是機體發(fā)揮天然免疫功能的重要組分，同時對獲得性免疫也起到一定調(diào)節(jié)作用。和 T、B淋巴細(xì)胞不同，NK細(xì)胞不表達(dá)抗原特異性受體，其功能的發(fā)揮主要依賴于NK細(xì)胞表面一系列抑制性和活化性受體，調(diào)節(jié)細(xì)胞的活性。NK細(xì)胞主要受自體MHCⅠ類分子特異性受體負(fù)性調(diào)節(jié)，當(dāng)此受體不發(fā)生交聯(lián)時，靶細(xì)胞被裂解。因此，NK細(xì)胞的殺傷對象主要是一些不表達(dá)或低表達(dá)M HCⅠ類分子的靶細(xì)胞。同樣，當(dāng)接觸不相合的異源靶細(xì)胞時，NK細(xì)胞識別自體MHCⅠ類分子發(fā)生障礙，從而引起異源性反應(yīng)(“丟失自我”學(xué)說)。NK細(xì)胞表面重要的抑制性受體包括殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIR)和殺傷細(xì)胞凝集素樣受體 CD94/NKG 2A。由于所有個體均表達(dá)CD94/NKG 2A的配體HLAE，因此，表達(dá)CD94/NKG2A的NK細(xì)胞不發(fā)生異源性反應(yīng)。在人類，根據(jù)MHCⅠ類分子α1螺旋羧基末端的氨基酸不同，KIR識別3組 HLA等位基因配體，即 HLA-C組 1(Asn80)、HLA-C組2(Lys80)和HLA-Bw4。NK細(xì)胞異源性反應(yīng)發(fā)生于KIR配體不相合時。

在F1H-2d/b→H-2b移植動物模型中，移植前輸注供體抗受體異源性NK細(xì)胞后，受體可以接受含有超過致死劑量30倍的異源T細(xì)胞的骨髓移植物，但卻沒有GVHD的病理證據(jù)，推測原因是表達(dá)H-2d特異性Ly49A-G2受體不表達(dá)H-2b特異性Ly49C/I受體的供體NK細(xì)胞被激活從而殺死受體APC，而受體APC是啟動GVHD的重要細(xì)胞。體外實驗證實異源性NK細(xì)胞可以殺死急性髓細(xì)胞白血病(AML)、慢性髓細(xì)胞白血病、T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病和非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞等[10]。臨床前期動物模型中，輸注異源性NK細(xì)胞可以消除NOD/SCID鼠移植的人AM L細(xì)胞。

單倍體相合移植時，在移植物抗宿主方向(GVH)KIR配體不相合情況下，供體NK細(xì)胞識別的自身HLAⅠ類分子在受體中沒有表達(dá)，抑制活化信號缺失，從而被激活，產(chǎn)生異源性反應(yīng)。在KIR配體不相合的57例成年AM L患者，復(fù)發(fā)率降低的同時，GVHD的發(fā)生率也明顯降低。將HLA和KIR基因分型與NK細(xì)胞異源反應(yīng)性功能鑒定相結(jié)合尋求單倍體相合供者的概率從30%增加到60%[11]。Ruggeri[12]研究還發(fā)現(xiàn)，85例接受單倍體移植的AML患者中，輸注供者異源反應(yīng)性NK細(xì)胞組的GVHD明顯降低。100多例單倍體相合移植治療AML的研究證實，NK異源反應(yīng)是患者生存改善的獨立預(yù)測因子。無關(guān)供體移植時，NK細(xì)胞異源反應(yīng)增強了GVL效應(yīng)[13]。

3.3 CD4+CD25+T細(xì)胞(T reg) 調(diào)節(jié)性CD4+CD25+T細(xì)胞(Treg)正常在胸腺中發(fā)育成熟，組成性表達(dá)CD25(IL-2受體α鏈)，在人類和鼠CD4+細(xì)胞中占5%～10%，MHCⅡ類分子的表達(dá)在其發(fā)育中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)自身免疫過程。Treg特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FoxP3，與細(xì)胞發(fā)育及抑制功能有關(guān)，它的突變導(dǎo)致免疫失調(diào)。大量證據(jù)表明共刺激分子和細(xì)胞因子在T reg發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，但其具體機制不清楚。T細(xì)胞對自身抗原的耐受是在胸腺內(nèi)發(fā)育過程中經(jīng)過克隆刪除或誘導(dǎo)無能形成的，一些自身特異性T細(xì)胞可以逃逸到外周，此時需要外周免疫耐受機制控制T細(xì)胞反應(yīng)。Treg保證了外周免疫耐受機制的正常發(fā)揮。在許多不同的Treg缺陷的動物模型中，觀察到多種T細(xì)胞介導(dǎo)的器官特異性自身免疫性疾病，且可以通過輸注Treg得到防治。體外實驗已經(jīng)證實，當(dāng)受到抗CD3單克隆抗體或異源APC刺激時，T reg呈現(xiàn)低反應(yīng)性。Yamazaki[14]證實，體外Treg可以抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(M LR)。

發(fā)生異源性或自體GVH D的一個重要原因是外周免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)缺失，從而下調(diào)異源反應(yīng)性或自體反應(yīng)性T細(xì)胞的能力下降。因此，外周免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)的重建對GVHD的防治起關(guān)鍵作用。有學(xué)者比較了接受供體總T細(xì)胞和缺乏Treg的T細(xì)胞的受鼠中GVH D的發(fā)生率，結(jié)果表明移植物中缺乏Treg時顯著加速GVHD誘導(dǎo)的死亡，當(dāng)共輸注T細(xì)胞和等量的Treg時，顯著推遲，甚至阻止了GVHD的發(fā)生。只有供體來源而非受體來源的Treg產(chǎn)生這種效應(yīng)。Masteller等[15]比較了異源抗原擴增的T reg和多克隆Treg對受鼠GVHD發(fā)生的影響，結(jié)果表明，接受后者的受鼠脾臟、肺和肝臟出現(xiàn)組織學(xué)GVHD征象，而接受前者的受鼠沒有或僅殘留GVHD征象，因此，相對多克隆Treg，抗原特異性 Treg治療GVHD更加有效。但這并不意味著Treg對免疫反應(yīng)的抑制是抗原特異性的，它的活化需要TCR的激活，活化的Treg在體外是以抗原非依賴性方式作用的。抗原特異性T reg可以避免大量輸注多克隆Treg造成的一些不良反應(yīng)，如降低對腫瘤和感染的免疫等。在A20白血病模型中，CD8+而非CD4+T細(xì)胞體外可以裂解A 20細(xì)胞，而體外培養(yǎng)的T reg對CD4+T細(xì)胞的抑制作用更強[16]。所以，Treg抑制GVHD的效應(yīng)比GVL的效應(yīng)更強，它能將二者有效分開，但這需要進(jìn)一步證實。

臨床BMT中 Treg對GVHD的調(diào)節(jié)作用的證據(jù)很少，Miura[17]的研究表明，與沒有 GVHD臨床癥狀的患者比較，發(fā)生GVHD的患者外周血淋巴細(xì)胞Foxp3 m RNA表達(dá)水平顯著降低，急性 GVHD患者中，F(xiàn)oxp3 m RNA表達(dá)水平和GVHD的嚴(yán)重程度負(fù)相關(guān)，認(rèn)為CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞在調(diào)節(jié)異源免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Sakagucki[18]研究了CD62L+和CD62-兩個不同CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群與急性GVHD致死率的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與供者CD4+CD25-T細(xì)胞一起移植時，僅CD4+CD25+CD62L+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群具有阻止嚴(yán)重組織損傷和保護受者免受致死性急性GVHD的作用。CD62L是非常重要的淋巴細(xì)胞歸巢受體及T細(xì)胞分化中的細(xì)胞表面分子。在移植早期，CD4+CD25+CD62L+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群較CD4+CD25+CD62L-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群能更多地進(jìn)入宿主腸系膜淋巴結(jié)及脾臟內(nèi)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能夠進(jìn)入這些致病性自身反應(yīng)性T細(xì)胞聚集場所的能力是其具有避免急性GVH D發(fā)生的先決條件。

對Treg調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的機制提出了很多觀點，包括釋放調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子(如IL-10、TGF-β)，誘導(dǎo)T細(xì)胞無能以及反應(yīng)性T細(xì)胞的凋亡等[19]。一致認(rèn)為細(xì)胞之間的接觸是發(fā)揮其調(diào)節(jié)功能所必需的。

3.4 其他細(xì)胞 正常成熟樹突狀細(xì)胞(m DCs)是刺激T細(xì)胞免疫的強力APC，而正常不成熟樹突狀細(xì)胞(iDCs)參與外周T細(xì)胞免疫耐受的誘導(dǎo)。由于iDCs在炎癥刺激下可以轉(zhuǎn)變成m DCs，所以，不適于臨床上免疫疾病的治療。有學(xué)者分離出人和鼠調(diào)節(jié)性DCs(rDCs)，表達(dá)高水平的MHC分子，但共刺激分子表達(dá)量很低，激活異源反應(yīng)性T細(xì)胞能力減弱，相反可以強烈誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫耐受，即使在炎癥條件下，其免疫調(diào)節(jié)功能也不會降低。當(dāng)骨髓移植后輸注宿主M HC相合rDCs時，急性GVHD導(dǎo)致的致死率顯著降低，對GVL的效應(yīng)沒有明顯影響，rDCs對急性GVHD的控制在于體內(nèi)誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受以及對效應(yīng)T細(xì)胞的直接抑制，且對CD4+T細(xì)胞的誘導(dǎo)免疫耐受的作用大于CD8+T細(xì)胞，而CD8+T細(xì)胞主要參與GVL效應(yīng)，因此，輸注rDCs對GVL效應(yīng)的影響不大。

影響GVHD和GVL的T細(xì)胞功能上至少存在4種，包括CD4+輔助性 T細(xì)胞(Th1和Th2)和 CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc1和 Tc2)，Th1和 Tc1主要分泌Ⅰ型細(xì)胞因子(IL-2和IFN-γ)，而Th2和Tc2主要分泌Ⅱ型細(xì)胞因子(IL-4、IL-5和IL-10)。Ⅰ型和Ⅱ型細(xì)胞因子的平衡對GVHD的發(fā)生、發(fā)展起到重要作用。Fowler和Gress[20]發(fā)現(xiàn)動物實驗中，輸注體外擴增的Th2/Tc2表型T細(xì)胞可以促進(jìn)HLA不相合異源移植物的植入，降低GVHD的發(fā)生率，同時Th2/Tc2細(xì)胞通過穿孔素和顆粒酶途徑殺死腫瘤細(xì)胞。人特異性Tc1和Tc2在體外已經(jīng)擴增成功，將進(jìn)一步推進(jìn)臨床應(yīng)用。

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