趙沃華 吉訓(xùn)明 凌 鋒 吳 浩 趙洪洋 朱賢立

1華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科,武漢 430022

2首都醫(yī)科大學(xué)北京宣武醫(yī)院神經(jīng)外科,北京 100085

為模擬臨床上動脈內(nèi)溶栓和藥物灌洗治療,我們根據(jù)經(jīng)典實心線栓大腦中動脈(middle cerebral atery,MCA)缺血模型的制作方法[1],利用特制的帶導(dǎo)絲的中空管,制作了中空管線栓MCA缺血模型,并觀察了經(jīng)中空管灌洗冷生理鹽水達到腦局部低溫的效果。

1 材料和方法

1.1 動物及分組

30只成年雄性SD大鼠,體重260～300 g,分為經(jīng)典線栓組、中空管線栓組和低溫鹽水灌洗組。實驗前1 d晚上開始禁食不禁水。大鼠經(jīng)口氣管插管接小動物呼吸機(Model 683,Harvard儀器公司,美國)和麻醉機(Model 61010,A.M Bickford公司,美國)。麻醉劑選用3.5%恩氟烷,混合于70%一氧化氮和30%氧氣的混合氣體中。肌肉注射維庫溴銨(Norcuron,萬可松,0.6 mg/kg)維持麻醉狀態(tài)。右側(cè)股動脈置PE-50管,與壓力感受器連接,持續(xù)記錄平均動脈壓。定期監(jiān)測大鼠血氣(248 pH血氣分析儀,Chiron Diagnostics Limited,英國)和血糖(ACCU-CHEK Active GN 03173351,羅氏公司,德國)。大鼠置于小動物控溫毯(TCAT-2AC,Harvard儀器公司,英國)及特制顳肌溫度反饋加熱頭燈下。在整個手術(shù)操作過程中維持直腸溫度在37.5℃,右側(cè)顳肌溫度維持在37℃。

1.2 經(jīng)典線栓MCA缺血模型制作

根據(jù)Longa等[1]的方法,略作改動。顯露和游離右側(cè)頸總動脈主干及頸內(nèi)動脈和頸外動脈近端。電凝后切斷右側(cè)頸外動脈近分叉處分支,3-0絲線于頸外動脈分叉處15～20 mm結(jié)扎并切斷頸外動脈。微型動脈夾臨時阻斷右側(cè)頸總動脈血流。選取外徑0.24 mm的prolene線段,經(jīng)頸外動脈殘端插入。插入深度約為18～21 mm,根據(jù)腦血流量監(jiān)測結(jié)果監(jiān)測線栓是否到位。線栓到位后,在頸外動脈殘端處結(jié)扎固定線栓。松開頸總動脈微型動脈夾。要求頸總動脈血流臨時阻斷時間＜5 min?？p合皮膚。缺血2 h后,大鼠再次麻醉,拔除線栓,使血液再灌注,頸外動脈殘端結(jié)扎,皮膚縫合。

1.3 中空管線栓MCA缺血模型制作

用特制的中空管線栓替代傳統(tǒng)實心線栓制作MCA缺血模型。30 mm長的PE50管,一端在酒精燈下烤熱并拉伸,用螺旋測微器測量頭端直徑,選取頭端直徑為0.24 mm的栓子,內(nèi)腔以恰好通過直徑0.11 mm的尼龍線為宜。頭端修剪為長25 mm,尾端為正常PE50管,長度為5 mm;內(nèi)腔注入肝素化生理鹽水,再插入長35 mm,直徑為0.11 mm尼龍線,浸泡在肝素化鹽水中,作為中空管線栓。模型制作方法同經(jīng)典線栓組。

1.4 局部生理鹽水灌洗模型制作

如上法制作中空管線栓MCA缺血模型,在血液再灌注之前10 min,將中空管線栓向后拔出約2～3 mm,拔出中空管內(nèi)的尼龍線,以微量泵向中空管內(nèi)注入20℃生理鹽水約6 mL(泵入速度為0.6 mL/min,持續(xù)約10 min)。在向動脈內(nèi)灌洗生理鹽水時,頸總動脈血流以微型動脈夾臨時阻斷。灌洗結(jié)束后,撤除右側(cè)頸總動脈臨時阻斷夾,拔除中空管線栓,使血液再通。頸外動脈殘端結(jié)扎。

1.5 局部腦血流量的測定

應(yīng)用激光血流測定儀(PeriFlux System 5000,Perimed AB公司,瑞典),對右側(cè)MCA供血區(qū)皮質(zhì)血流進行測定。大鼠麻醉后,在前囟后方3 mm,外側(cè)3 mm以高速磨鉆鉆孔。將塑料測量電極固定器以EC耳腦膠牢固固定于大鼠顱骨上。在缺血開始前測定腦血流的基線值。當(dāng)線栓到位時,腦血流測定值至少需降至基線值的25%以下。未達到上述標(biāo)準(zhǔn)的大鼠排除在實驗組之外。

1.6 腦溫監(jiān)測

皮質(zhì)測溫點選取前囟外側(cè)3 mm處,深度約3 mm;髓質(zhì)測溫點選取前囟后方3 mm,外側(cè)5 mm,深度約5 mm。將針狀測溫電極插入,連接測溫儀(Physitemp儀器公司,美國);在動脈內(nèi)生理鹽水灌洗前,灌洗過程中和灌洗后 60 min內(nèi),觀察右側(cè)MCA供血區(qū)腦組織溫度。

1.7 神經(jīng)功能評定

在大鼠缺血前、缺血中(缺血開始后1 h)、缺血后24和48 h分別對大鼠肢體運動功能進行評定。采用Belayev等[2]推薦的十二分法對大鼠運動功能進行評定。神經(jīng)功能評分為0～12分,正常是0分,最高12分。

1.8 腦梗死體積的測定

腦缺血48 h后,大鼠以過量苯巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉,4%多聚甲醛心臟灌注。大鼠腦組織置于特制大鼠腦冠狀切片適配器上,從前到后(從額極至枕極)取冠狀切片6片。腦組織置于溫四氮唑紅(tetrazolium chloride,TTC)溶液中染色15～30 min。數(shù)碼相機照相,以圖像分析軟件Image Proplus 5.0測量腦梗死體積。為減少腦水腫造成的誤差,采用Swanson等[3]推薦的間接法進行腦梗死體積的計算。

1.9 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 生理指標(biāo)

平均動脈壓、直腸溫度、血糖水平和血氣指標(biāo)在整個實驗過程中維持在基本正常水平。各實驗組之間的結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05)。在應(yīng)用低溫鹽水灌洗時,顳肌溫度和直腸溫度略有下降,但也維持在36.5℃以上;停止低溫鹽水灌洗后,逐漸恢復(fù)至正常水平。

2.2 神經(jīng)功能評分

中空管線栓缺血組大鼠在缺血后1、24和48 h的神經(jīng)功能評分[分別為(10.10±0.82),(6.10±1.20)和(4.30±1.34)]同經(jīng)典線栓缺血組各時間段神經(jīng)功能評分[分別為(9.60±1.17),(6.10±1.20)和(4.90±1.45)]相比,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.258,1.000,0.291);低溫鹽水灌洗組1 h時神經(jīng)功能評分(10.00±0.82),與同時間段中空管線栓組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.819),而24和48 h神經(jīng)功能評分[分別為(2.30±1.16)和(1.90±0.88)]與同時間段中空管線栓組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.01)。

2.3 腦溫監(jiān)測

在低溫鹽水灌洗組中,在血液再灌注之前,經(jīng)中空管注入20℃冷生理鹽水,MCA供血區(qū)皮質(zhì)溫度從(37.0±0.1)℃降低至(32.8±0.2)℃,髓質(zhì)溫度從(37.5±0.1)℃降低至(33.2±0.3)℃。

2.4 腦梗死體積

經(jīng)典線栓組和中空管線栓組的腦梗死范圍類似,均位于同側(cè)的顳頂部。中空管線栓組的腦梗死體積[(41.81±2.88)%]同經(jīng)典線栓組[(41.92±2.17)%]相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.922);而低溫鹽水灌洗組腦梗死體積[(22.37±1.86)%]同中空管線栓組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討論

我們模擬臨床上動脈內(nèi)溶栓的方法,建立了大鼠中空管線栓MCA腦缺血模型。當(dāng)線栓堵塞MCA開口處,可以造成MCA供血區(qū)缺血;拔除中空管線栓,可以使血液再灌注。當(dāng)回拉線栓1～2 mm,抽出中空管內(nèi)導(dǎo)絲,經(jīng)中空管向MCA供血區(qū)注入冷生理鹽水,可以達到缺血區(qū)腦局部低溫。

目前應(yīng)用最廣泛的MCA缺血模型是Longa等[1]所改進的線栓MCA缺血模型,具有無需開顱、操作簡單、梗死體積穩(wěn)定、重復(fù)性好等特點。我們改良的模型,以中空管線栓,代替?zhèn)鹘y(tǒng)線栓,能更好地模擬臨床上介入治療急性腦缺血的過程。同傳統(tǒng)線栓模型相比,中空管線栓模型能夠產(chǎn)生類似的神經(jīng)功能癥狀,腦梗死的范圍和體積也基本相同。

急性MCA閉塞靜脈內(nèi)溶栓建議在癥狀開始3 h之內(nèi)進行,動脈內(nèi)溶栓建議在癥狀開始6 h之內(nèi)進行;否則,過長的缺血時間可能加重腦水腫,并增加腦出血的風(fēng)險[4]。動脈內(nèi)溶栓治療是將高濃度的溶栓藥物直接應(yīng)用于血栓處,較靜脈內(nèi)溶栓能夠降低溶栓藥物濃度,增加血管再通率,減少溶栓藥物的副作用[4]。雖然動脈內(nèi)溶栓治療需要在發(fā)病后盡早進行,但很多患者到達醫(yī)院時,已經(jīng)超過了溶栓治療的時間窗,失去了最佳的治療時機[4-5]。因此,盡可能延長動脈內(nèi)治療的時間窗是缺血性腦血管病治療的重要方面。

在對缺血性腦損害的研究中,低溫治療是目前唯一在實驗研究和臨床研究均證實對人有效的神經(jīng)保護措施[6]。目前,誘導(dǎo)低溫的方法主要包括身體表面應(yīng)用冰毯,冷空氣降溫,乙醇皮膚擦浴,或者在頭部、腹股溝、腋窩和頸部放置冰袋等。也有介紹應(yīng)用靜脈內(nèi)熱交換機應(yīng)用于臨床誘導(dǎo)全身低溫的報道[7]。但是應(yīng)用這些方法,為了誘導(dǎo)和維持靶點溫度,需要耗費醫(yī)務(wù)人員大量的精力,并可能引起嚴(yán)重并發(fā)癥,如心律失常、寒顫、感染和凝血功能障礙等。

應(yīng)用我們的方法,達到的動脈內(nèi)局部低溫具有以下特點:

①動脈內(nèi)局部低溫是僅對缺血局部腦區(qū)的低溫。局部頭部低溫同全身低溫相比,效果類似,但并發(fā)癥更少。我們所用的局部動脈內(nèi)低溫的方法,是對局部缺血腦區(qū)的低溫,對側(cè)腦組織溫度變化相對較小,對全身溫度的影響就更小。

②20℃低溫生理鹽水局部動脈內(nèi)灌洗可達到輕度低溫。雖然中度低溫和深低溫具有明顯的保護作用,但也有很多的副作用,如心律失常、寒顫、肺部感染等。輕度低溫的治療效果可能不如重度低溫,但是并發(fā)癥明顯減少。在我們的實驗中,應(yīng)用20℃生理鹽水灌洗達到的低溫屬于輕度低溫的范圍。Ding等[8]的實驗中應(yīng)用類似方法,缺血區(qū)皮質(zhì)和髓質(zhì)溫度分別降低至33.4和33.9℃。

③動脈內(nèi)局部低溫開始于血液再灌注之前。目前現(xiàn)有的低溫實施時機有缺血期低溫、再灌注期低溫和缺血期持續(xù)至再灌注期低溫。缺血發(fā)生當(dāng)時就實施低溫在理論上和實驗中是可行的,但在臨床實際工作中往往是很難做到的?；颊叽蠖际窃诎l(fā)病后就診的,有一個就診的過程,所以無法在缺血當(dāng)時就實施低溫。在實驗研究中,開始應(yīng)用低溫治療的時機不一。一般認(rèn)為,低溫應(yīng)用得越晚,效果就可能越差。

④動脈內(nèi)局部低溫持續(xù)時間約1 h。在先前的研究中,低溫的持續(xù)時間多在1～3 h之間。研究發(fā)現(xiàn),較長時間的低溫,能更明顯減少腦梗死體積。我們所應(yīng)用的局部動脈內(nèi)低溫,持續(xù)時間約1 h左右。

⑤局部鹽水灌洗可能在預(yù)防缺血再灌注損傷方面也具有一定的作用。Ding等[9]發(fā)現(xiàn)應(yīng)用37℃常溫鹽水動脈內(nèi)灌洗,能夠減少缺血腦組織細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)的表達和減少白細(xì)胞向缺血區(qū)域的浸潤。而ICAM-1是急性炎癥反應(yīng)的表達產(chǎn)物,能夠誘導(dǎo)血液中的白細(xì)胞向缺血區(qū)浸潤。本實驗中大鼠腦梗死體積的減少和神經(jīng)功能評分的好轉(zhuǎn),也有可能是局部鹽水灌洗,減少了再灌注損傷引起的炎性反應(yīng)。

臨床上,借助導(dǎo)管可以到達急性梗塞的腦血管(最常見是MCA),進行機械溶栓或者抽吸血凝塊。通過微導(dǎo)管也可以經(jīng)動脈內(nèi)給予溶栓藥物。機械性溶栓,可以機械粉碎血凝塊,同時結(jié)合藥物溶栓的方法,也已經(jīng)應(yīng)用于臨床。在血液再灌注之前,導(dǎo)管通過梗塞部位,到達梗塞血管的遠端,先進行缺血局部鹽水灌洗的方法是可行的。由于人的血管比大鼠的血管管徑要粗得多,在臨床上應(yīng)用動脈內(nèi)局部灌洗相對要容易很多。這種方法同樣為低溫治療聯(lián)合血管內(nèi)藥物治療,提供了新的途徑。

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