邱美珍，傅勝才，周志雄 ，周望平，杜麗飛，王紅兵，曾 勝

(1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南 長沙 410131；2.湖南省桃江縣高橋鄉(xiāng)動物防疫站，湖南 桃江 413400;3.湖南農業(yè)大學，湖南 長沙 410128)

豬繁殖與呼吸綜合征 (PRRS)于1987年首先報道于美國，現(xiàn)已遍及全球主要養(yǎng)豬國家和地區(qū)。我國1995年首次暴發(fā)此病并從PRRS疑似病例中分離到PRRSV。目前根據(jù)臨床和血清學調查，該病在我國普遍存在，而且近年來還呈流行態(tài)勢，新的變異病毒株層出不窮，加之新老疫病交替感染，使生豬疫情越來越復雜，多病因混合感染導致疫病流行強度和危害程度顯著增加，給養(yǎng)豬業(yè)造成毀滅性破壞，如何快速及時診斷PRRS成了畜牧業(yè)的研究熱點。本文就臨床診斷，血清學診斷和病原診斷研究進展作一綜述。

1 臨床診斷

1.1 臨床癥狀

PRRSV可以引起各種年齡的豬群發(fā)生疾病，但是其表現(xiàn)各不相同，其中最為典型的兩種臨床表現(xiàn)就是母豬繁殖障礙和斷奶仔豬呼吸系統(tǒng)疾病。同時該綜合征又以急性、慢性、亞臨床癥狀三種表現(xiàn)形式更為普遍。臨床癥狀通常在感染后的2～7天表現(xiàn)出來，維持大約1周。

母豬感染后臨床表現(xiàn)為發(fā)情期延遲、發(fā)情間期延長、受胎率降低、分娩率降低、厭食、發(fā)熱、嗜睡、呼吸困難、嘔吐、皮膚損傷與變色、早產(chǎn)（107～113天）、懷孕后期的流產(chǎn)、死胎、弱仔、木乃伊胎、無乳以及少數(shù)的死亡等；公豬感染了該病以后，精液品質和產(chǎn)量都有降低；哺乳仔豬感染后，表現(xiàn)的臨床癥狀主要有快速的腹式呼吸、嗜睡、精神抑郁、斷奶前死亡率增加、二次感染發(fā)病率增加；保育仔豬感染后，表現(xiàn)為快速的不正常呼吸、打噴嚏、厭食、被毛粗亂、行動遲緩以及偶爾的死亡。關于呼吸道癥狀，在臨床上，許多感染豬有著嚴重的呼吸道癥狀，可是在實驗條件下卻很難復制呼吸道癥狀，這可能是由于PRRSV和細菌的脂多糖（LPS）產(chǎn)生協(xié)同作用，增強了感染豬只的呼吸道癥狀。

1.2 病理特點

PRRSV能引起豬只肺、胸腺、肝、扁桃體、脾、心、腎和淋巴結多系統(tǒng)感染，但是大體病變僅出現(xiàn)在幾個有限的組織器官（即呼吸系統(tǒng)和淋巴組織），新生豬和哺乳仔豬感染的特征性病變和顯微鏡下病變最為明顯。由于在野外的條件，PRRSV常常與一種或多種其他病原發(fā)生混合感染，病理變化更加復雜。新生豬和哺乳仔豬感染PRRSV后，肺呈紅褐色，不塌陷。淋巴結腫大，呈褐色，成為診斷PRRSV的標志。在顯微鏡下，可以看到間質性肺炎。腦、扁桃體、淋巴結和心臟的顯微鏡下檢查具有診斷學意義。還發(fā)現(xiàn)肺有不同程度的水腫，肺泡及肺泡膈水腫和炎性細胞浸潤，大腦軟腦膜及腦實質毛細血管淤血，透明血栓形成。

2 血清學診斷的方法

2.1 免疫過氧化物酶單層實驗(IPMA)

1991年由Wensvoort等建立，至今仍是歐洲國家檢測該病的常用方法。IPMA應用最早且使用廣泛，敏感性與特異性都較好，可以用于PRRSV的抗原檢測、病毒的鑒定、血清抗體的檢測。實驗主要在PAM、CL2621、MARC-145細胞上進行，能在感染后6日血清中檢測到PRRSV抗體，具有較高的特異性。但是，該實驗終點判斷主觀性較強，且不利于自動化操作，不適合大規(guī)模的檢測。

2.2 間接熒光抗體試驗（IFA）

由Yoon等于1992年首次報道建立的?？梢杂肞AM、CL2621、MARC-145細胞培養(yǎng)物進行IFA。該方法與IPMA相似，特異性和敏感性都較好，并且簡單易行，易于推廣，可以在感染后2～3周檢測出抗體，因此己經(jīng)成為歐美各國官方認可的權威檢測方法之一。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

由Albina等用PAM接種PRRSV培養(yǎng)制備陽性抗原，首次建立了檢測PRRSV抗體的間接ELISA。Takikawa等PRRSV接種MARC-145制備抗原，改進了檢測PRRSV抗體的ELISA方法。Nodelijk G等比較了IPMA和ELISA方法用來檢測PRRSV的效果，通過實驗他們發(fā)現(xiàn)，IPMA能夠比ELISA早2～3d檢測出抗體，然而ELISA卻能在不損失特異性的基礎上提高敏感性，相比之下，ELISA更適合用來診斷PRRSV。目前，ELISA是檢測PRRS最常用的方法之一，主要是因為該方法經(jīng)濟簡便、檢測結果快、重復性好、相對客觀、能自動顯示結果、可以大批量的操作，便于大規(guī)模的檢疫。

2.4 血清中和試驗（SN）

檢測PRRSV特異性較好，但是中和抗體出現(xiàn)時間較遲，一般要在感染后4～6周出現(xiàn)。中和抗體比IFA抗體維持時間要長，一般可以維持半年以上，但是對于急性感染的敏感性較差，要求血清無污染，而且細胞培養(yǎng)工作量大，技術性強，目前僅僅限實驗室研究應用。

2.5 乳膠凝集試驗（LAT）

王忠利用純化的PRRSV重組M蛋白致敏乳膠制成乳膠抗原，成功地將LAT用于PRRSV血清抗體的檢測。LAT具有良好的特異性。用LAT與國外IDEXX公司PRRSV抗體檢測試劑盒同時對76份豬血清樣本進行檢測，結果表明LAT的特異性和敏感性均為95%，與IDEXX公司試劑盒的總符合率為87%，檢出率基本一致。因LAT具有操作簡便、快速、敏感性高、特異性強、價格低廉且可用于現(xiàn)場檢測等優(yōu)點，是一種適合基層獸醫(yī)單位檢測PRRSV血清抗體的新辦法。

3 病原學的診斷

3.1 病毒抗原檢測

檢測病毒抗原主要有免疫組織化學技術、免疫金技術和免疫熒光抗體染色技術。Halbur等率先建立檢測病豬PRRSV抗原的鏈酶親和素-生物素-免疫過氧化物酶方法，是診斷該病的最準確的方法之一，也可以用于檢測抗原的總體分布。Magar等報道使用特異性單克隆抗體建立了檢測PRRSV抗原的免疫金銀染色法（IGSS），人工感染實驗表明該方法可于感染后幾天之內從甲醛固定的感染組織中檢測到PRRSV抗原，具有較好的特異性和敏感性。1992年Benfield等制備了抗PRRSV核衣殼蛋白的單克隆抗體，這種抗體能與北美洲和歐洲的45株分離株反應。表明該單抗是針對這些分離株的保守抗原決定簇，應用異硫氰酸熒光素（FITC）標記該單抗，建立了免疫熒光抗體技術并用于直接檢測仔豬肺組織中的抗原。

3.2 病毒核酸檢測

RT-PCR和原位雜交（ISH）均已成功用于PRRSV感染組織的和各種樣品核酸的檢測。Sur等以PRRSV的RNA為模板，應用地高辛標記法制備了特異性的cDNA探針，建立了檢測PRRSV的RNA原位雜交技術。該技術可以確定病毒感染時的細胞和組織嗜性，特別適用于研究目的，但是技術含量高，難以用于臨床的診斷。

RT-PCR現(xiàn)在己經(jīng)廣泛用于PRRSV實驗室檢測，是由Saurez等根據(jù)LV株的ORF7的序列，設計一對特異性的引物而建立起來的。研究表明，RT-PCR技術可以用于肺泡巨噬細胞、血清、血漿等樣品的PRRSVRNA的檢測。具有高度的特異性和敏感性，檢測速度快，可檢測到組織培養(yǎng)物及精液中30個PRRSV感染單位，敏感性是病毒分離的10倍。該法可以避免散毒的危險，尤其適合沒有PRRSV感染的國家的檢疫。對于一些特殊樣品，如對細胞有毒性（精液）、已經(jīng)滅活的樣品、己被PRRSV抗體中和的樣品和病毒含量很低的樣品，使用RT-PCR技術檢測是一種很好的方法。

3.3 病毒的分離

病毒分離是診斷該病最為準確的診斷方法?？蓮牟煌慕M織器官中否可以分離到PRRSV病毒，最好采用死胎或者活產(chǎn)仔豬的肺、心、腦、腎、肝和脾等組織器官勻漿混合物，懷孕后期流產(chǎn)胎兒的血清也是很好的分離樣品。血清和肺組織分離成功率最高，尤其是血清，因其采集方便，所以成為最主要的樣本采集對象。另外，從豬群來看，最好是從保育豬和育肥豬采集病料進行病毒分離，因為PRRSV病毒的感染主要發(fā)生在這一時期?，F(xiàn)在用于PRRSV的分離和體外大量培養(yǎng)的細胞主要有豬肺泡巨噬細胞（PAM）、非洲綠猴腎細胞傳代細胞系CL2621和MARC-145（由MA104細胞進一步克隆而來）。PAM是PRRSV分離的最為敏感的細胞，MARC-145細胞對PRRSV具有高度的敏感性，可供多種毒株分離。不同毒株在不同的細胞上生長情況各不相同，有些毒株在第一代接種后需要3～5天才產(chǎn)生CPE，而有些則需要盲傳幾代后才能有CPE出現(xiàn)，還有些毒株即使在敏感細胞上也不能產(chǎn)生CPE。因此在進行病毒分離的同時，還應該結合IFA和IPMA等方法進行檢測，從而使結果更加可靠。

4 結語

目前，臨床上由于PRRS的癥狀復雜多樣、無特征性癥狀，病變不明顯、不典型，且常常繼發(fā)、并發(fā)其它疾病，故臨床診斷只能作為初步診斷。確診需進一步采取病料進行病毒的分離鑒定、血清學和病原學診斷。雖然病毒的分離是診斷該病最為準確的方法，但是有時有些毒株即使在敏感細胞上也不能增殖，而且有些毒株僅僅只能在特定的細胞上才能增殖，這就使實驗室診斷的可靠性也值得懷疑。因此，有效的診斷方法還有待進一步研究。

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