譚新穎，張焜和

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 江西省消化疾病研究所，南昌 330006）

從靶標(biāo)的多樣性看核酸適配子在分子識別中的優(yōu)勢與前景

譚新穎，張焜和*

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 江西省消化疾病研究所，南昌 330006）

20世紀(jì)90年代初，Tuerk等[1]建立了一種新的組合化學(xué)技術(shù)——指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），篩選到噬菌體T4 DNA聚合酶的RNA配體，即核酸適配子（aptamer）。核酸適配子能與生物靶分子高特異性和高親和力結(jié)合，功能上與抗體類似，在分子識別研究中具有重要價值，目前在生物醫(yī)學(xué)各個領(lǐng)域的相關(guān)研究中均有應(yīng)用。SELEX技術(shù)自創(chuàng)立以來不斷完善和發(fā)展，所用的篩選靶標(biāo)從最初的蛋白質(zhì)發(fā)展到目前的小到無機離子和多肽，大到細胞甚至組織，其靶標(biāo)多樣化程度遠非制備抗體的抗原多樣性可比擬，因而在分子識別中核酸適配子比抗體更具優(yōu)勢，應(yīng)用前景更為廣闊。本文在簡要介紹SELEX篩選技術(shù)及其基本原理的基礎(chǔ)上，就適配子篩選所用的主要靶標(biāo)類型作一綜述，從中可對適配子的優(yōu)勢和應(yīng)用前景窺見一斑。

1 SELEX篩選過程及其基本原理

適配子SELEX篩選的基本過程是先人工合成庫容量約1015的隨機單鏈DNA文庫，將其直接或轉(zhuǎn)錄為RNA后與靶標(biāo)孵育，然后分離結(jié)合核酸并PCR擴增，制備成下一輪與靶標(biāo)孵育的寡核苷酸文庫。重復(fù)若干輪孵育－分離－擴增過程，最后將文庫中能與靶標(biāo)高特異性及高親和力結(jié)合的單鏈寡核苷酸篩選并富集出來，克隆測序，鑒定其與靶分子結(jié)合的特異性和親和力，選擇能與靶分子高特異性和高親和力結(jié)合者用于靶分子識別的相關(guān)研究。

單鏈隨機寡核苷酸文庫中的單鏈寡核苷酸兩端約為20個堿基的固定序列（PCR引物結(jié)合區(qū)），中間為約30個堿基的隨機序列。單鏈寡核苷酸因序列不同，可形成構(gòu)象不同且熱力學(xué)上非常穩(wěn)定的二級和三級結(jié)構(gòu)，如發(fā)卡、口袋、假結(jié)、G四聚體等。由于隨機序列的存在，文庫中的單鏈寡核苷酸因序列各異而形成多樣而獨特的空間構(gòu)象，能與靶分子的空間構(gòu)象形成“鎖鑰”關(guān)系，并通過氫鍵、疏水結(jié)構(gòu)和離子鍵等與靶分子特異性結(jié)合。理論上，多達1014以上的隨機寡核苷酸文庫幾乎涵蓋了所有可能的立體構(gòu)象，可為自然界存在的所有分子“配型”，找到特異性的核酸配體。

2 分子靶標(biāo)

2.1 生物小分子

分子量小于10kD的生物小分子可以用作SELEX技術(shù)的靶標(biāo)，篩出相應(yīng)的適配子。Sassanfar等[2]以 ATP（分子量507.18）為靶標(biāo)篩選出一組RNA適配子，Huizenga等[3]用ss-DNA文庫也篩選到能與ATP結(jié)合的適配子，Lato等[4]篩選出了硼酸化ATP適配子。放射性核素硼（10B）可釋放中子破壞周圍細胞（范圍為5～9μm，約一個細胞大?。?，較傳統(tǒng)核素的放療有優(yōu)勢，但目前缺乏10B特異性腫瘤細胞靶向分子，硼酸化ATP適配子可為硼中子的腫瘤靶向化療提供新思路。

激素及神經(jīng)遞質(zhì)多為小分子生物活性物質(zhì)，通過SELEX技術(shù)可篩選出它們的核酸適配子。Bruno等[5]篩選得到乙酰膽堿（分子量146.21）的DNA適配子ACh 6R，可有效檢測膽堿能細胞。Lévesque等[6]篩選到甲狀腺素（分子量 776.93）的RNA適配子，能與甲狀腺素(T4)和三碘甲腺原氨素(T3)特異性結(jié)合，但不結(jié)合包括甲腺原氨酸(T0)在內(nèi)的無活性物質(zhì)。Nieuwlandt等[7]成功篩選到一組P物質(zhì)的RNA適配子，它們具有高度保守的二級結(jié)構(gòu)，通過交疊的復(fù)雜結(jié)構(gòu)與P物質(zhì)進行緊密結(jié)合。P物質(zhì)是一種含有11個氨基酸的多肽（分子量1.34kD），作為神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)在中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)中起著多種重要作用。上述適配子對于這些小分子生物活性物質(zhì)的含量檢測、功能阻斷具有潛在價值。

2.2 生物大分子 分子量10kD以上的生物大分子是SELEX篩選最常用的靶標(biāo)，有眾多相關(guān)的報道。

2.2.1 體液中的生物大分子 血液及其他體液中含有各種生物大分子，可作為SELEX篩選的良好靶標(biāo)。血管內(nèi)皮生長因子 （VEGF）是一種分子量為34～50kD的同源二聚體糖蛋白，廣泛分布于各種組織，是促血管生成的重要因素。Jellinek等[8]篩選到一組能與VEGF特異結(jié)合的RNA適配子，親和力達到pM水平，可以抑制VEGF與細胞表面受體結(jié)合。

免疫球蛋白是血液中一類重要的生物大分子，也可作為篩選靶標(biāo)。Biesecker等[9]篩選到補體C5（分子量190kD）的一組適配子，其中7個與補體C5具有高親和力（解離常數(shù)kd為20～40nM），能有效抑制人血清溶血反應(yīng)和酵母多糖誘導(dǎo)的C5a產(chǎn)生。他們還在結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上構(gòu)建了一個特定堿基序列的隨機RNA文庫，進行了二次篩選，篩選出具有更高親和力的適配子（解離常數(shù)為2～5nM），這些適配子在人類疾病的治療中具有潛在應(yīng)用價值。Mendonsa等[10]篩選到人IgE的DNA適配子，平均解離常數(shù)為29nM，能很好地區(qū)分人IgG和鼠IgE。

腫瘤標(biāo)志物多為蛋白，存在于各種體液中，其核酸適配子的篩選可用于這些標(biāo)志物的檢測和腫瘤的分子診斷蛋白。MUC1是一種廣泛存在于上皮細胞源性腫瘤的標(biāo)志物，在腫瘤的診斷與免疫治療中具有潛在應(yīng)用價值。Ferreira等[11]篩選到一組MUC1的DNA適配子，其檢測低限為1μg/ml，線性范圍在8～100μg/m l，可以滿足研發(fā)MUC1檢測試劑的要求。

2.2.2 細胞膜蛋白 細胞膜上存在大量的蛋白質(zhì)類功能分子，有的與胞膜的物質(zhì)轉(zhuǎn)運功能有關(guān)（如離子通道），有的與細胞辨認(rèn)和接受環(huán)境中特異的化學(xué)性刺激有關(guān)（統(tǒng)稱受體），有的與細胞的免疫功能有關(guān) （如CD分子）。它們也可作為SELEX篩選的靶標(biāo)。

Huang等[12]篩選到α-氨基羥甲基惡唑丙酸（AMPA）受體亞型GluR2的一組RNA適配子，具有穩(wěn)定的物理特性，其中適配子AN58可與NBQX（最強的GluR2受體抑制劑）競爭結(jié)合GluR2受體。AMPA受體是一種谷氨酸離子通道亞型，過度激活可導(dǎo)致相應(yīng)的離子大量內(nèi)流而引起細胞損傷，與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，上述適配子對研制AMPA受體的水溶性抑制劑以治療相關(guān)疾病具有重要價值。Toll樣受體（TLR）家族在宿主抗微生物免疫中具有重要作用，其表達異常與免疫性疾病的發(fā)生關(guān)系密切。Chang等[13]篩選出TLR2受體的適配子，其中一個適配子的Kd值僅為73pM，能有效阻斷TLR2，對相關(guān)細胞因子分泌水平抑制程度達80%以上，對TLR2功能異常具有潛在的治療價值。

以免疫細胞表面的免疫相關(guān)分子為靶標(biāo)可篩選出調(diào)控免疫功能的核酸適配子。McNamara等[14]篩選到小鼠共刺激分子4-1BB的適配子，在體外能共刺激T細胞活化，體內(nèi)能抑制小鼠的腫瘤生長。Kraus等[15]以重組sCD4為靶標(biāo)篩選出一組RNA適配子，能敏感而特異地結(jié)合CD4分子，與CD4單抗具有相似的免疫抑制作用。

2.2.3 病原微生物蛋白或產(chǎn)物 因缺乏有效藥物，病毒成為目前對人類健康危害最大的病原微生物，不少研究以病毒的功能蛋白為靶標(biāo)篩選相應(yīng)的適配子，以期為病毒的診治提供新的手段。

人免疫缺陷病毒-1（HIV-1）的Rev蛋白作為一種核質(zhì)穿梭蛋白，對病毒的復(fù)制起關(guān)鍵作用。Tuerk等[16]篩選出特異性的HIV Rev蛋白的RNA適配子，結(jié)構(gòu)分析顯示適配子的兩個區(qū)域能夠與Rev蛋白特異結(jié)合。Li等[17]篩選到發(fā)生耐藥變異的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的適配子，只特異性結(jié)合變異的逆轉(zhuǎn)錄酶，可用于耐藥變異HIV的檢測和治療。

Lee等[18]以丙型肝炎病毒（HCV）核心抗原為靶標(biāo)篩選到的RNA適配子只與核心抗原特異性結(jié)合，不與非結(jié)構(gòu)5區(qū)（NS5）蛋白結(jié)合，可用于檢測血清中的HCV核心抗原而診斷HCV感染。Fukuda等[19]篩選的適配子能與HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3酶活性位點(△NS3)特異性結(jié)合，并能抑制其90%的酶活性，具有潛在治療價值。

人類流感病毒表面表達的血凝素(HA)是決定流感病毒A、B型的關(guān)鍵標(biāo)志，可據(jù)此鑒別病毒亞型，對臨床診斷及流行病學(xué)研究十分重要。Subash等[20]成功篩選出B型人類流感病毒的HA特異性適配子，與A型病毒株的HA無結(jié)合能力。Cheng等[21]篩選出禽流感病毒株H5N1的重組體HA1蛋白的一組DNA適配子，其中一個適配子具有較強的親和力且能抑制H5N1病毒復(fù)制，為開發(fā)預(yù)防禽流感藥物以及控制其傳播提供了新思路。

正常朊病毒蛋白PrP(C)和病態(tài)朊病毒蛋白PrP(Sc)尚缺乏敏感、特異的試劑來區(qū)分。Bibby等[22]應(yīng)用鼠類朊病毒蛋白質(zhì)重組體為靶標(biāo)，篩選到24個高親和力的ssDNA適配子，其中4個適配子能特異性與鼠朊病毒蛋白質(zhì)結(jié)合，大多數(shù)同時也能和人和羊的朊病毒蛋白質(zhì)結(jié)合，解離常數(shù)8～79 nM不等，為后續(xù)的朊病毒蛋白的檢測分析奠定了基礎(chǔ)。

結(jié)核桿菌分泌的早期分泌抗原靶6(early secretary antigenic target-6,ESAT-6)在抗結(jié)核分支桿菌感染的免疫應(yīng)答中起重要作用，可將ESAT-6作為區(qū)分結(jié)核分支桿菌感染和卡介苗接種或環(huán)境分枝桿菌感染的特異性抗原。馬占忠等[23]以ESAT-6為靶蛋白篩選出ssDNA適配子，為結(jié)核病診斷和治療藥物的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

2.3 化學(xué)藥物 化學(xué)藥物分子量小，難以制備相應(yīng)的抗體，但卻可以作為靶標(biāo)篩選相應(yīng)的適配子，用于藥物檢測分析。

四環(huán)素類是在四環(huán)素化學(xué)基團5,6位碳原子上存在差異的一類抗生素，例如氧四環(huán)素（土霉素）和去氧四環(huán)素（阿霉素）等。Niazi等[24]利用氧四環(huán)素、去氧四環(huán)素和普通四環(huán)素分別做靶標(biāo)和反篩靶標(biāo)，篩選出了20個四環(huán)素基團特異的ss-DNA適配子，其中7個對普通四環(huán)素主鏈有較高的親和力（Kd=63～483 nM），對四環(huán)素同型異構(gòu)體的特異性結(jié)合的程度為氧四環(huán)素>四環(huán)素>阿霉素，這種四環(huán)素特異性適配子可用于靶藥物轉(zhuǎn)運和四環(huán)素制備中的檢測及純度分析。

環(huán)孢霉素A(cyclosporin A，CsA)是含11個氨基酸的環(huán)狀多肽，為器官移植后臨床常用的免疫抑制劑，有較嚴(yán)重的肝、腎毒性，故定期監(jiān)測病人血液中CsA的濃度，對減少或避免毒副反應(yīng)、保證療效、提高移植病人的存活率至關(guān)重要，但傳統(tǒng)的熒光偏振免疫法和高效液相色譜法檢測存在著成本高等問題，李衛(wèi)濱等[25]篩選到針對CsA的ssDNA特異性適配子，為建立檢測血液CsA濃度的快速而簡便檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

3 微生物靶標(biāo)

完整的病毒顆粒、細菌都可以是適配子篩選的靶標(biāo)，可同時篩出與多個位點結(jié)合的適配子，是一種高效的復(fù)合篩選。Nitsche等[26]以牛痘病毒為靶標(biāo)篩選出DNA適配子，能抑制牛痘病毒及其他痘科病毒感染，具有濃度依賴性。Chen等[27]篩選到結(jié)核菌株 (H37Rv)的高親和力和高特異性適配子NK2，與H37Rv結(jié)合后可只促進CD4+T細胞分泌IFN-γ；體內(nèi)注射NK2可使感染H37Rv小鼠的壽命明顯延長，脾臟的細菌數(shù)明顯減少，肺組織的肺泡融合和腫脹減輕。甄蓓等[28]以炭疽芽孢桿菌疫苗株A.16R芽孢為靶標(biāo)，篩選獲得的適配子文庫的親和力是原始文庫的37倍，二級結(jié)構(gòu)分析顯示這些適配子通過5’端的莖-環(huán)和發(fā)卡結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)結(jié)合，而臨近堿基的三級結(jié)構(gòu)則維持其穩(wěn)定性，有可能成為一種有效的炭疽桿菌的分子診斷工具。還有人篩選出葡萄球菌、淋病奈瑟菌等其它細菌適配子。

4 真核細胞靶標(biāo)

以活的真核細胞為靶標(biāo)，可進行所謂的Cell-SELEX，篩選出細胞表面分子的適配子。Cell-SELEX具有簡單、高效、直接、可重復(fù)等特點，最大的優(yōu)點是無需特定靶分子的相關(guān)知識，因而在惡性腫瘤的診斷及生物標(biāo)志物研究方面具有良好的前景。目前主要以腫瘤細胞為靶標(biāo)進行此類篩選。

白血病細胞以單細胞狀態(tài)存在于血液中，是Cell-SELEX的理想靶標(biāo)。Shangguan等[29]用人類急性T淋巴細胞性白血病(T-ALL)的CCEF-CEM細胞株作為靶細胞，人類B細胞系淋巴瘤CRL-1596細胞株為陰性細胞（反篩），篩選出一組核酸適配子，能夠特異地識別靶細胞，而不與正常造血細胞、淋巴瘤和骨髓瘤細胞結(jié)合。他們在對適配子的后續(xù)分析中，發(fā)現(xiàn)白血病細胞高表達跨膜蛋白——蛋白酪氨酸激酶 7 (PTK7)，并認(rèn)為是T-ALL的特異性生物標(biāo)記物[30]。

實體瘤細胞也可作為Cell-SELEX篩選的靶標(biāo)。Chen等[31]以小細胞肺癌細胞為靶標(biāo)篩選到的多個適配子，能高親和力和高特異性結(jié)合不同來源的肺癌細胞（包括來自于肺癌標(biāo)本者）；將適配子與磁性熒光納米粒聯(lián)結(jié)后，可從含有混合細胞的培養(yǎng)基中分離、富集和敏感地檢測靶細胞。Shangguan等[32]以源于小鼠肝細胞的MEAR肝癌細胞系靶標(biāo)，用BNL肝細胞系進行消減篩選（MEAR由BNL經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)而得），獲得納摩水平親和力的肝癌細胞株MEAR的特異性適配子，能在小鼠模型中與肝癌細胞特異性結(jié)合。這項結(jié)果提示癌細胞特異性適配子將有可能成為體內(nèi)診斷與治療的靶向分子。

5 結(jié)束語

核酸適配子與抗體相似，都可用于靶分子的識別，且敏感性和特異性有時好于抗體。在兩者的制備過程中，核酸適配子在靶標(biāo)上有明顯的優(yōu)勢。篩選適配子的靶標(biāo)可以小到無機分子，大到完整的活細胞，甚至組織[33]，而制備抗體的靶標(biāo)主要為蛋白質(zhì)，且必須具有免疫原性，但不能有毒。相比之下，兩者所針對的靶分子范圍相差甚遠。不僅如此，核酸適配子的制備過程本身也較抗體更簡單、不需要體內(nèi)過程、耗時更短、可人工合成。此外，從適配子與抗體之間理化性質(zhì)的差異也可看到核酸適配子的優(yōu)勢，如性質(zhì)穩(wěn)定、無免疫原性、分子量較小。因而核酸適配子的篩選與應(yīng)用研究已應(yīng)用于醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域，如基礎(chǔ)研究、臨床診斷、疾病治療和藥物研發(fā)等方面?？梢灶A(yù)見，核酸適配子的篩選靶標(biāo)會進一步豐富，所涉及的領(lǐng)域會進一步擴展，在醫(yī)學(xué)中應(yīng)用前景會更加廣闊。

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B

1674-1129(2010)02-0161-04

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江西省科技攻關(guān)項目（20061B03032400）；江西省衛(wèi)生廳重大指標(biāo)項目 （20074001）；江西省教育廳科技項目（2006061）；江西省研究生創(chuàng)新基金項目（YC07A022）

*通訊作者