陳 陵,梁光萍,湯旭東,余松濤,黎 川,李 寧,李長(zhǎng)珠,王國(guó)珍,房殿春,楊仕明

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院全軍消化病研究所;2.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院全軍燒傷研究所,重慶,400038)

端粒(telomere)是存在于染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu),人和其它脊椎動(dòng)物的端粒DNA均為(5′-T TAGGG-3′)n,大小5～ 20 kb[1]。每次細(xì)胞有絲分裂后,端粒都會(huì)縮短,縮短到一定程度后細(xì)胞就不可避免的發(fā)生衰老死亡[2]。因此,能無(wú)限分裂增殖的細(xì)胞必定有延長(zhǎng)其端粒的能力,這一能力在絕大多數(shù)情況下正是通過(guò)端粒酶來(lái)實(shí)現(xiàn)[3]。如果缺乏端粒酶活性,由于DNA聚合酶不能完整復(fù)制線型的DNA末端,端粒將會(huì)在每次細(xì)胞分裂后喪失一部分5′DNA;累積的端粒縮短會(huì)造成細(xì)胞增殖速度的減慢,乃至衰老。轉(zhuǎn)染端粒酶催化亞基至人正常體細(xì)胞,則其端粒長(zhǎng)度的維持作用可使細(xì)胞保持表型的年輕狀態(tài)[4]。抑癌基因突變的細(xì)胞中,若端粒酶過(guò)度激活,則可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)約90%[5-6]人類惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)端粒酶。而正常人體,除造血干細(xì)胞、生殖細(xì)胞等分裂旺盛的細(xì)胞低度表達(dá)端粒酶外,其余均為陰性[7],這使得端粒酶有可能成為廣譜抗腫瘤治療靶位[8-9]。這使得端粒酶活性調(diào)控機(jī)制成為研究熱點(diǎn)。端粒酶激活及調(diào)節(jié)機(jī)制雖然尚未明確,但有關(guān)這方面的研究近年來(lái)不斷取得了新的進(jìn)展。

1 端粒酶的發(fā)現(xiàn)、作用及意義

端粒實(shí)質(zhì)上即真核生物染色體末端的特殊結(jié)構(gòu),由一段串聯(lián)重復(fù)的富G(鳥(niǎo)嘌呤堿基)DNA序列(TTAGGG)及相關(guān)蛋白組成。自Blackburn[10]在四膜蟲(chóng)(Tetrahymena)中發(fā)現(xiàn)了端粒具有重復(fù)序列以來(lái),不同物種的端粒相繼測(cè)定。端粒的重復(fù)長(zhǎng)度在各物種并不相同。如人類為5～20 kb,大鼠為20～100 kb,小鼠為100～150 kb[11]。端粒一方面具有穩(wěn)定染色體末端、防止染色體的異常重組、端-端融合及染色體丟失等作用,另一方面端粒長(zhǎng)度維持在一定范圍之內(nèi)又是細(xì)胞有絲分裂正常進(jìn)行的保證[12]。染色體DNA在沿著5′—3′,方向復(fù)制過(guò)程中,由于DNA聚合酶不能進(jìn)行全長(zhǎng)復(fù)制,導(dǎo)致端粒長(zhǎng)度隨著細(xì)胞有絲分裂的不斷進(jìn)行而逐漸縮短。利用染色體末端限制片段分析法(TRFs),顯示人正常體細(xì)胞每年約丟失15～40 bp的端粒。同時(shí),大多數(shù)正常體細(xì)胞隨著其染色體端粒的不斷丟失,也逐漸喪失了分裂的能力,細(xì)胞即呈現(xiàn)出衰老的表現(xiàn),當(dāng)端?？s短超過(guò)某一臨界范圍時(shí),將最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13]。由此可見(jiàn),端粒的長(zhǎng)短和穩(wěn)定與細(xì)胞的生命活動(dòng)密切相關(guān),是細(xì)胞壽命的“記時(shí)器”。端粒長(zhǎng)度的維持是由端粒酶來(lái)完成的,端粒酶補(bǔ)充缺失端粒的方式是以自身的RNA亞單位作為模板,以蛋白質(zhì)亞單位進(jìn)行催化,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄方式完成,但在大多數(shù)正常體細(xì)胞中并不能檢測(cè)到端粒酶的活性,正因?yàn)槿绱?才能保證細(xì)胞有絲分裂的正常進(jìn)行。但在發(fā)生于不同組織部位的惡性腫瘤標(biāo)本中,幾乎都可以檢測(cè)到端粒酶的活性。1994年Kim[14]利用端粒重復(fù)擴(kuò)增法(telomeric repeat amplification proteocol TRAP)檢測(cè)了18種不同腫瘤組織的100個(gè)永生細(xì)胞株,其中98個(gè)為端粒酶活性株,而同時(shí)檢測(cè)的22個(gè)正常細(xì)胞株則全為陰性株。其后越來(lái)越多的證據(jù)也表明在惡性腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)了端粒酶活性的激活。Minghong等的實(shí)驗(yàn)證實(shí),在20例卵巢惡性腫瘤和17例潛惡性腫瘤(LMP)中,都含有端粒酶的活性,而在24例卵巢囊腺瘤中,僅有5例有端粒酶活性。這種端粒酶與惡性腫瘤的顯著相關(guān)性表明,在腫瘤細(xì)胞中,端粒酶由于某種原因重新被激活,維持了染色體末端端粒的長(zhǎng)度,使部分腫瘤細(xì)胞逃脫衰老死亡,成為永生細(xì)胞,獲得了無(wú)限增殖的能力。端粒酶在(惡性)腫瘤形成和發(fā)展過(guò)程中所發(fā)揮的關(guān)鍵作用,也為腫瘤的治療提供了新的思路和努力方向。端粒酶的發(fā)現(xiàn)和最終確定具有重要的現(xiàn)實(shí)意義,它可以使人類對(duì)細(xì)胞的衰老和死亡有著更本質(zhì)的了解,一旦內(nèi)源或外源性的端粒酶抑制被發(fā)現(xiàn)或合成,將會(huì)把腫瘤的治療推向一個(gè)新的高度。

2 細(xì)胞因子對(duì)端粒酶活性的調(diào)控

由于端粒酶在造血細(xì)胞、生殖細(xì)胞、腫瘤發(fā)生及發(fā)展中均起重要作用,對(duì)端粒酶調(diào)控機(jī)制的研究吸引著眾多研究者注意。按調(diào)控作用位點(diǎn)的不同,分述如下。

2.1 結(jié)合于端粒的相關(guān)蛋白對(duì)端粒酶的調(diào)控

TRF美國(guó)約洛克菲勒大學(xué)Susan Smith和T.de Lange的研究小組在90年代初期[15],發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)與端粒DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì):端粒重復(fù)結(jié)合因子(telomeric repeat binding factor-1 TRF)1和2。其中 TRF2對(duì)端粒具有保護(hù)作用,而TRF1則是端粒長(zhǎng)度的負(fù)向調(diào)節(jié)因子[16]。在端粒酶活性的細(xì)胞株中,TRF1的過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致端粒長(zhǎng)度的進(jìn)行性縮短,這一作用是通過(guò)阻礙端粒酶與端粒的結(jié)合而發(fā)揮的,而不是通過(guò)控制端粒酶的表達(dá)。

Tankyrase在發(fā)現(xiàn)TRF1對(duì)端粒酶的調(diào)控作用后,研究人員推測(cè)可能存在著一種與T RF1結(jié)合的蛋白質(zhì),由它來(lái)調(diào)節(jié)TRF1的功能。這一猜想已經(jīng)被Smith S et al[17]1998年的研究結(jié)果證實(shí),并將這種蛋白質(zhì)命名為端錨聚合酶(Tankyrase,T RF1-interactin,ankyrin-related ADP-ribose poly-merase)。正常情況下,TRF1結(jié)合在染色體的端粒上,使端粒酶不能對(duì)缺失的端粒進(jìn)行修復(fù),而在血細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及產(chǎn)生精子、卵子的細(xì)胞中,與 TRF1結(jié)合的 Tankyrase則可以把TRF1從端粒上移開(kāi),從而使端粒酶發(fā)揮作用。Tankyrase的發(fā)現(xiàn),無(wú)疑為惡性腫瘤的治療開(kāi)辟了新的途徑。如果Tankyrase的作用確實(shí)如此,那么針對(duì) Tankyrase的抗腫瘤藥物可以通過(guò)抑制Tankyrase,使端粒酶不能接近端粒,無(wú)從發(fā)揮端粒酶使獲得永生的腫瘤細(xì)胞重新死亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Tankyrase包括 TANK1和TANK2。TANK1是端粒的正向調(diào)控因子,同TRF1結(jié)合后,使TRF1糖基化不能與端粒重復(fù)序列結(jié)合,失去對(duì)端粒酶的抑制功能,因此過(guò)表達(dá)TANK1可使端粒延長(zhǎng)[18]。TANK2(85%與Tank1同源)亦與TRF1作用,過(guò)表達(dá)TANK2導(dǎo)致細(xì)胞迅速死亡[19]。

hPot1 Pot1(protection of telomere)蛋白為單鏈結(jié)合蛋白,在T-loop的基礎(chǔ)上與3′末端富G鏈結(jié)合。Pot1具有重要的端粒保護(hù)作用,去除裂殖酵母的Pot1基因立即導(dǎo)致其端粒序列迅速丟失,端端融合,細(xì)胞死亡,只有少數(shù)細(xì)胞通過(guò)染色體環(huán)化幸存[20]。人Pot1先前被鑒定為管家基因,其mRNA在人的所有器官中均能檢測(cè)出來(lái),利用間接的免疫熒光法確定hPot1定位于人細(xì)胞間期的端粒上[20]。hPot1基因有22個(gè)外顯子,大多數(shù)在cDNA均檢測(cè)出來(lái),但有4個(gè)外顯子在某些轉(zhuǎn)錄中出現(xiàn)跳躍現(xiàn)象,產(chǎn)生5種異構(gòu)體,其中4種于所有細(xì)胞中均表達(dá),第5種有白細(xì)胞特異性,5種不同的蛋白與3′末端結(jié)合能力差別極大[21]。生化分析表明,hPot1能結(jié)合在端粒的單鏈DNA末端的任何部位[22]。hPot1可能參與端粒酶對(duì)染色體的調(diào)控,在T-loop展開(kāi)后保護(hù) 3′端粒DNA。當(dāng)它與端粒末端單鏈結(jié)合時(shí),端粒酶不能識(shí)別其引物,從而不能啟動(dòng)端粒的延長(zhǎng)。

2.2 存在于細(xì)胞膜的端粒酶調(diào)控相關(guān)蛋白

細(xì)胞膜上存在一些與端粒酶活性共同表現(xiàn)的分子事件。例如,在表現(xiàn)端粒酶活性的人類表皮細(xì)胞亞群中,細(xì)胞共表達(dá)整合素β1(integrin betal)和表皮生長(zhǎng)因子(EGRE),而端粒酶活性呈陰性的細(xì)胞亞群中,表達(dá)神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(NGFR)p75、整合素β4(integrin be-ta4)和 bcl-2蛋白[23]。又例如,在靜息T細(xì)胞中,低親和的神經(jīng)生長(zhǎng)因子能激活端粒酶,但這一過(guò)程要求TCR和CD28-B7的共同存在[24]。

3 基于hTERT亞單位的端粒酶活性調(diào)控

3.1 hTERT的結(jié)構(gòu)、功能

人端粒酶復(fù)合體由3個(gè)主要的亞單位組成:端粒酶 RNA組分(hTR),端粒酶相關(guān)蛋白(TP1/TEP1)和端粒酶催化亞單位(hTERT)。hTERT編碼基因由Meyerson et al[25]和Nakamura et al[26]兩個(gè)研究小組于1997年分別在不同的實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)克隆,分別命名為 hEST2和hTERT。hTERT編碼的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量Mr 127 000,包含1 132個(gè)氨基酸,有7個(gè)逆轉(zhuǎn)錄酶的基序(motif)和1個(gè)端粒酶特異的基序,因此它歸于逆轉(zhuǎn)錄酶家族中的一員。其基因位于5號(hào)染色體短臂的最末端(5p15.33)[27],為一單拷貝基因,長(zhǎng)度為40 kb,目前在人類基因組中未發(fā)現(xiàn)其它相關(guān)基因。hTERT是端粒酶的催化亞基,與人端粒酶相關(guān)蛋白(hTEP1)結(jié)合形成復(fù)合物全酶,激活端粒酶的活性。hTERT僅表達(dá)于腫瘤及部分癌前病變組織中,而正?；蚰[瘤旁組織幾乎全為陰性。相反,人類的端粒酶RNA亞基(human telomerase RNA,hT R)和端粒酶其它蛋白組分,如P80同源蛋白TP1的mRNA表達(dá)在兩類細(xì)胞中都相對(duì)豐富[25]。hTERT基因?qū)朐静荒芑蛑荒苡邢迋鞔脑囵B(yǎng)細(xì)胞,如毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞[13]、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞[28]、臍帶內(nèi)皮細(xì)胞[29]、腎近端小管上皮細(xì)胞[30]、肝內(nèi)皮細(xì)胞[31]、直結(jié)腸隱窩細(xì)胞[32]、乳房上皮和基質(zhì)細(xì)胞[33]、骨關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞[34]、牙乳頭、牙髓、牙周膜、牙齦成纖維細(xì)胞[35]、包皮纖維母細(xì)胞[36]、人胚胎成纖維細(xì)胞[37]等,可誘導(dǎo)這些細(xì)胞永生化從而進(jìn)一步建立細(xì)胞系,或明顯延長(zhǎng)其壽命[38]。而人胚神經(jīng)祖細(xì)胞(hNPC)在轉(zhuǎn)染hTERT后則出現(xiàn)惡性表型[39],如失去正常二倍體核型,接觸抑制消失,不附壁也可生長(zhǎng),可在裸鼠體內(nèi)形成神經(jīng)母細(xì)胞瘤樣腫瘤等。國(guó)內(nèi)楊仕明等亦發(fā)現(xiàn)[40-43],在胃癌、腸癌及肝癌,端粒酶的三個(gè)亞單位中TP1及hTR在癌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá),在癌旁正常組織內(nèi)也有或多或少的表達(dá);hTERT則僅在癌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá),在癌旁正常組織內(nèi)極少表達(dá),且hTERT的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度成正相關(guān)。轉(zhuǎn)染hTERT cDNA到端粒酶陰性的原代培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)后,可檢測(cè)到端粒酶表達(dá)[32-33,37,44]。這表明作為端粒酶的限速成分,hTERT在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)端粒酶活性起主要調(diào)控作用。hTERT是端粒酶活性的限速亞單位,對(duì)端粒酶的活性起著決定作用。因此,對(duì)hTERT表達(dá)的調(diào)控因子,同時(shí)也間接調(diào)控著端粒酶的活性。

3.2 基于hTERT的端粒酶活性調(diào)控

就端粒酶亞單位水平面言,端粒酶的活性表達(dá)主要是通過(guò)hTERT基因的轉(zhuǎn)錄機(jī)制嚴(yán)格調(diào)控的,但hTERT基因的調(diào)節(jié)機(jī)制到目前為止所知甚少。已發(fā)發(fā)現(xiàn)的幾個(gè)可能控調(diào)hTERT基因表達(dá)的因子有如下幾個(gè)。①C-myc是hTERT轉(zhuǎn)錄的直接激活因子之一。近年來(lái)研究進(jìn)一步表明,c-myc的過(guò)度表達(dá)可能是惡性腫瘤中端粒酶活性升高的一個(gè)重要機(jī)制。Horikawa等[45-46]研究發(fā)現(xiàn)在核心啟動(dòng)子區(qū)域和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)下游各存在一個(gè)典型的E-box(CACGTG),它們是c-myc原癌基因產(chǎn)物潛在的結(jié)合位點(diǎn),其中上游E-box可以使hTERT啟動(dòng)子活性顯著上調(diào),是正向調(diào)節(jié)元件,下游E-box對(duì)hTERT啟動(dòng)子活性影響不大。C-myc基因與Max蛋白以螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸鋅指結(jié)構(gòu)(bHLH-Zip)形成異源二聚體結(jié)合到E-box上,從而激活hTERT的轉(zhuǎn)錄。Mad蛋白是c-myc蛋白的拮抗物,能使Myc/Max二聚體結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)镸ad/Max二聚體,從而降低hTERT啟動(dòng)子的活性。②Sp1也是結(jié)合到hTERT核心啟動(dòng)子GC富含位點(diǎn)和激活 hTERT轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵分子[47]。在核心啟動(dòng)子上有5個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn),每個(gè)位點(diǎn)的突變都將導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活性不同程度地降低,而當(dāng)5個(gè)Sp1位點(diǎn)同時(shí)突變,則核心啟動(dòng)子的活性下降90%以上。多個(gè)Sp1位點(diǎn)是一種有效的順式作用元件。因此,核心啟動(dòng)子5′末端的E-box和3′末端Sp1的結(jié)合對(duì)于hTERT的轉(zhuǎn)錄激活是非常重要的。C-myc和Sp1的協(xié)同作用能激活hTERT啟動(dòng)子的全部活性。③Wang等[48]發(fā)現(xiàn)具有啟動(dòng)hTERT轉(zhuǎn)錄的雌激素反應(yīng)元件(estrogen response elements,EREs),在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 754bp,可以結(jié)合雌激素及其受體,應(yīng)用此EREs序列與報(bào)告基因相連導(dǎo)入細(xì)胞,在應(yīng)用雌激素作用后,轉(zhuǎn)錄活性可以提高10倍。④P53蛋白是一種與細(xì)胞周期相關(guān)的核磷酸蛋白,對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用是抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡。P53蛋白能與 Sp1結(jié)合,抑制 Sp1與hTERT啟動(dòng)子結(jié)合[5]。激活 SL2細(xì)胞中hTERT啟動(dòng)子的活性,完全依賴于異位表達(dá)的Sp1,而P53可以取消這種激活作用;P53通過(guò)與Sp1形成P53-Sp1復(fù)合物而抑制Sp1與hTERT核心啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,此作用需要P53全長(zhǎng)基因序列的參與。p21與 E2F可能介導(dǎo)了 p53對(duì)hTERT的抑制作用[49]。⑤WT1(Wilms′tumor 1 tumor suppressor)是hTERT轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控的抑制因子[50]。WT1通過(guò)特異地與Sp1競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-281bp處的“GCGCGGGCG”序列(Sp1結(jié)合位點(diǎn))而抑制hTERT的轉(zhuǎn)錄。⑥hTERT的核移位是其活性調(diào)節(jié)的重要機(jī)制,因?yàn)閔TERT在胞質(zhì)合成,但需在胞核內(nèi)發(fā)揮作用。在TNF-α的刺激下,NF-κ B P65亞基與胞質(zhì)中的hTERT瞬間結(jié)合,并共同移位于核內(nèi),使核內(nèi)端粒酶活性明顯升高[51]。⑦蛋白激酶C和Cdc42/Rac1 Yeh et al[52]發(fā)現(xiàn),蛋白激酶C(protein kinase C-zeta,PKC zeta)可正向調(diào)控人鼻咽癌細(xì)胞端粒酶活性,而PKC zeta的活性由 Cdc42/Rac1正向調(diào)控,因此推測(cè)抑制Cdc42/Rac1之后,也可下調(diào)端粒酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,采用短鏈反義寡苷酸序列下調(diào)Cdc42/Rac1表達(dá)水平后,端粒酶活性受到抑制。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),瞬時(shí)表達(dá)Cdc42/Rac1的無(wú)功能突變體,同樣可以抑制端粒酶活性。人鼻咽癌細(xì)胞株NPC-076在PKC的抑制劑(bisindolylmaleimide I和H-7)作用下,端粒酶的活性明顯下降[53]。Kim et al[54]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),PKC正向調(diào)控端粒酶活性的作用是通過(guò)hTERT實(shí)現(xiàn)的,PKC在這一端粒酶調(diào)控通路中可能起重要作用。⑧其它可能參與hTERT調(diào)控的因子晚近發(fā)現(xiàn),孤兒受體COUPTFII能與hTERT啟動(dòng)子特異作用,抑制hTERT的表達(dá)[55-56]。而TEIF(transcriptional elementsinteracting factor)[57]與EWS/ETS癌蛋白[58-59]通過(guò)與hTERT啟動(dòng)子結(jié)合,上調(diào)hTERT mRNA,激活端粒酶活性。此外,Wang et al[60]發(fā)現(xiàn),在端粒酶陰性的細(xì)胞內(nèi)曲古抑菌素A抑制組蛋白去乙?；负?可導(dǎo)致hTERT基因在染色質(zhì)相應(yīng)功能區(qū)的開(kāi)放及hTERT的轉(zhuǎn)錄,這提示組蛋白去乙?；缚赡茉谌旧|(zhì)水平負(fù)向調(diào)節(jié)hTERT的表達(dá)。Banik et al[61]發(fā)現(xiàn),PinX1在體內(nèi)可通過(guò)結(jié)合到已裝配的hTERT/hTR復(fù)合體而抑制端粒酶活性。核因子kappaB(nuclear factor kappaB,NF-kappaB)被發(fā)現(xiàn)可能起激活hTERT的作用[62-63]。Zhong et al[64]發(fā)現(xiàn),在成釉細(xì)胞瘤,端粒酶的活性與pRb的低表達(dá)和E2F-1的高表達(dá)有關(guān),并在G(1)未期可被細(xì)胞周期素E上調(diào)。1,25二羥維生素D3也可下調(diào)端粒酶活性[65]。Guilleret et al[66]還發(fā)現(xiàn),端粒酶陽(yáng)性的細(xì)胞內(nèi)CpG島的高度甲基化是端粒酶表達(dá)的一個(gè)必要條件。新近,活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)被發(fā)現(xiàn)可結(jié)合到hTERT啟動(dòng)子區(qū),在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)hTERT的表達(dá)[67]。

4 基于miRNA的端粒酶活性轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用

以上有關(guān)端粒酶表達(dá)調(diào)控的研究大多為轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié),未涉及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)主要涉及 microRNA(即 miRNA)[68]。隨著miRNA的發(fā)現(xiàn)及其功能的闡明,miRNA在端粒酶活性調(diào)換中的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)。由于端粒酶的主要限速亞單位是hTERT,因此miRNA主要通過(guò)對(duì)hTERT的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控參與端粒酶活性的調(diào)節(jié)。miRNA是一種廣泛存在于真核生物細(xì)胞中、非編碼的、長(zhǎng)19-24nt的單鏈小分子RNA,首先在線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)可時(shí)序調(diào)控胚胎發(fā)育,隨后在多種動(dòng)物、植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miRNA分子的存在,目前已有4 000多種miRNA被鑒定出來(lái)。據(jù)估計(jì),在人類基因組中至少存在1 200條miRNA,是最大的一類基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子[69]。miRNA的廣泛存在與進(jìn)化保守性,提示它在生命活動(dòng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用。miRNA的基因通常成簇存在,多個(gè)miRNA基因共同轉(zhuǎn)錄成一個(gè)前體miRNA,并由該miRNA前體加工成多個(gè)成熟的miRNA。在表達(dá)上具有時(shí)序性和組織特異性。成熟的miRNA與Argonaute蛋白家庭成員結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物(RISC),該復(fù)合物與靶mRNA的3′URT結(jié)合,然后對(duì)靶mRNA進(jìn)行切割或者翻譯,對(duì)靶基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)向調(diào)控。miRNA調(diào)控基因表達(dá)的方式主要有三種[70]:與靶向 mRNA完全互補(bǔ),通過(guò)經(jīng)典的RNAi途徑降解mRNA;與mRNA在部分錯(cuò)配的情況下實(shí)現(xiàn)不完全互補(bǔ)配對(duì),從而抑制蛋白翻譯,不過(guò)此時(shí)mRNA水平并不會(huì)降解;指導(dǎo)靶向基因的mRNA快速脫腺苷化,進(jìn)而導(dǎo)致mRNA的快速衰減和表達(dá)水平的降低。miRNA對(duì)靶基因的調(diào)節(jié)并非一對(duì)一的,一條miRNA可以調(diào)控?cái)?shù)百個(gè)靶基因的表達(dá),而一個(gè)基因亦可同時(shí)被多個(gè)miRNA分子調(diào)控[68]。并且,極微量的miRNA即可對(duì)靶蛋白的表達(dá)產(chǎn)生明顯的調(diào)控作用[71]。由于miRNA對(duì)包括腫瘤相關(guān)蛋白在內(nèi)的多種蛋白起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用,其表達(dá)譜的改變,在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有重要作用。參與hTERT調(diào)控的miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要意義,可作為潛在的腫瘤治療靶位[68,72]。目前有關(guān)miRNA調(diào)控hTERT表達(dá)的研究?jī)H見(jiàn)一篇文獻(xiàn)報(bào)道。Mitomo et al[73]。根據(jù)以往文獻(xiàn)挑選了10條在甲狀腺癌與相應(yīng)正常組織表達(dá)有差異的miRNA,檢測(cè)它們?cè)趆TERT陽(yáng)性的甲狀腺癌(ATC)與hTERT陰性的甲狀腺癌(PTC)中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)miR-138在ATC中表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在hTERT的3'UTR端,具有miR-138的結(jié)合位點(diǎn);并且,上調(diào)miR-138可抑制hTERT表達(dá),而抑制miR-138的表達(dá),則可恢復(fù)hTERT的表達(dá),從而確認(rèn)了miR-138對(duì)hTERT具有調(diào)控作用。

5 端粒酶的應(yīng)用性研究與展望

敲除端粒酶的轉(zhuǎn)基因小鼠,對(duì)皮膚源性腫瘤發(fā)生具有抵抗性[74];而高表達(dá)端粒酶的轉(zhuǎn)基因小鼠,與野生型小鼠相比,更易患上皮源性腫瘤[75]。端粒酶與腫瘤發(fā)生之間的密切關(guān)系,已經(jīng)被大量的基因和臨床研究證實(shí)。端粒酶的直接或間接抑制劑不僅可以用于腫瘤的治療[74],而且端粒酶活性的高低還可以用來(lái)對(duì)一些臨床良性表現(xiàn)、但具有潛在惡性變的腫瘤的發(fā)展趨勢(shì)給予判斷。此外,端粒酶的測(cè)定在腫瘤的檢測(cè)和預(yù)后效果的估價(jià)上也有重要意義。雖然端粒酶在細(xì)胞衰老和腫瘤惡變中扮演了重要的角色,但在此過(guò)程中仍然存在很多疑問(wèn)。如端粒酶究竟在腫瘤發(fā)生的哪一階段被激活?激活的機(jī)制是什么?人體的一些細(xì)胞終生表現(xiàn)端粒酶的活性,端粒酶抑制劑的應(yīng)用對(duì)這些細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生何種影響?

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