余松濤,黎 川,陳 陵,湯旭東,房殿春,楊仕明

(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院全軍消化病研究所,重慶,400038)

隨著對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能、分子生理和病理、細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路研究的深入,人類對(duì)疾病和對(duì)生命本質(zhì)的認(rèn)識(shí)不斷被追朔到蛋白質(zhì)、基因水平。在上個(gè)世紀(jì)發(fā)展起來的CT、MRI、PFT、超聲等宏觀影像技術(shù)已經(jīng)遠(yuǎn)不能滿足對(duì)活體環(huán)境內(nèi)細(xì)微生命過程的探詢。組織切片和免疫染色能夠部分解釋一些生物現(xiàn)象,但是需要研究對(duì)象與活體組織的分離,所得結(jié)果與其在活體內(nèi)機(jī)制難免有所偏離,甚至完全相反。熒光染料(fluorescent dye)能對(duì)多種細(xì)胞共價(jià)標(biāo)記并進(jìn)行活體顯像,但多被限制于體外培養(yǎng)的細(xì)胞。其化學(xué)毒性和對(duì)活體內(nèi)環(huán)境的化學(xué)干擾使其在活體應(yīng)用受到極大限制。熒光蛋白和螢光素酶作為具有生物活性的蛋白質(zhì),在活體內(nèi)無毒、無放射損傷、可代謝、可穿過各種膜屏障。它們的編碼基因片段小,可以被融合標(biāo)記于絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和細(xì)胞,甚至可以對(duì)整個(gè)生物體進(jìn)行全身背景標(biāo)記。在不影響生物體任何結(jié)構(gòu)和功能的前提下,這些熒光基團(tuán)配合外部檢測設(shè)備可以對(duì)各種體內(nèi)生物現(xiàn)象進(jìn)行實(shí)時(shí)活體顯像。

1 熒光與生物發(fā)光

目前醫(yī)學(xué)研究應(yīng)用得最多的熒光基團(tuán)實(shí)際上包括激發(fā)熒光蛋白所得到的熒光和體內(nèi)化學(xué)反應(yīng)所得的生物發(fā)光兩類:天然熒光蛋白經(jīng)一定波長的激發(fā)光照射后發(fā)出的光叫熒光(Fluorescence);螢光素酶催化相應(yīng)底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的螢光叫生物發(fā)光(bioluminescence),實(shí)質(zhì)上是一種化學(xué)發(fā)光。

1.1 熒光蛋白及其應(yīng)用

熒光是指某些特殊物質(zhì)如熒光蛋白經(jīng)特定波長的激發(fā)光(入射光,通常是短波高能的紫外線)照射,吸收光能后由基態(tài)進(jìn)入激發(fā)態(tài)、并立即返回基態(tài),同時(shí)發(fā)出比入射光波長更長的發(fā)射光(出射光,通常是長波低能的紅外或可見光)。這種發(fā)光具有瞬時(shí)性。激發(fā)光一旦停止照射出射光隨即停止。自然界的熒光蛋白有很多種。最初被人類發(fā)現(xiàn)的是綠色熒光蛋白(GFP),由Chalfic等1994年從維多利亞水母(Aequorea Victoria)發(fā)光現(xiàn)象中分離純化出的基因[1-2]。近年來一些新發(fā)現(xiàn)的具有長波長發(fā)射譜的天然熒光蛋白或人工突變體被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究[3-5]。

美國抗癌研究所Hoffman等[6]長期以來利用熒光蛋白進(jìn)行各種活體成像的探索。他們構(gòu)建了多種全身表達(dá)熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,將待研究腫瘤細(xì)胞標(biāo)記上的其他顏色的熒光蛋白植入體內(nèi)不同部位,在宏觀范圍活體觀察腫瘤的增殖,侵襲,轉(zhuǎn)移,極其與血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的相互作用[7]。在微觀活體單個(gè)細(xì)胞水平觀察亞細(xì)胞生物事件時(shí),有學(xué)者在體表半分離一帶蒂皮瓣(reversible skin-flap widow),使其既有血供,又能被拉伸成為半透明組織,供高敏CCD探頭觀察其內(nèi)被標(biāo)記的細(xì)胞結(jié)構(gòu)[8-11]。

近年來,在同一活體生物利用兩種顏色的熒光蛋白標(biāo)記不同組織或同一細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu),研究各種細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-血管、激素-受體等相互作用生物過程,已經(jīng)得到成熟應(yīng)用[12-14]。hoffman等[15]用GFP和RFP分別標(biāo)記不同亞系的人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080,靜脈注射后觀察其在肺的轉(zhuǎn)移灶熒光。通過對(duì)純紅和純綠的光團(tuán)計(jì)數(shù),得到不同亞系的轉(zhuǎn)移能力和腫瘤細(xì)胞之間相互作用的影像學(xué)資料。在另一實(shí)驗(yàn)中,他們將全身表達(dá)GFP的小鼠體內(nèi)植入表達(dá) RFP的腫瘤細(xì)胞[15],在4～8周的時(shí)間跨度內(nèi)觀察了腫瘤與宿主血管、淋巴細(xì)胞、纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DC細(xì)胞的相互作用。同樣的,凝血因子[16]、免疫細(xì)胞[17]等也可以用熒光蛋白標(biāo)記,對(duì)其在其內(nèi)的生物學(xué)行為和調(diào)控反應(yīng)進(jìn)行成像。

1.2 生物發(fā)光和螢光素酶[18]

1.2.1 螢光素酶生物發(fā)光系統(tǒng):生物發(fā)光過程本質(zhì)是一種化學(xué)反應(yīng)。生物體內(nèi)的螢光素酶催化相應(yīng)的底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)發(fā)出的波長介于500～700 nm之間的生物光(bioluminescence),也被稱為熒光。自然界有無數(shù)種類似的螢光素酶-底物熒光發(fā)生系統(tǒng)。最受生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的是細(xì)菌發(fā)光和海洋生物發(fā)光。這些生物體內(nèi)都含有Lux發(fā)光基因操縱子,同時(shí)表達(dá)螢光素酶及其底物,不需要外源底物即可發(fā)光。應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生物發(fā)光系統(tǒng)有北美螢火蟲螢光素酶[19](North America firefly luciferase,Fluc)和海腎螢光素酶(renilla luciferase,Rluc)及其底物。螢光素酶產(chǎn)生的生物發(fā)光主要特點(diǎn)是不需激發(fā)光而需要底物和氧氣。其波長比熒光蛋白發(fā)出的熒光長,穿透組織能力相應(yīng)更強(qiáng)。由于不需要激發(fā)光,能夠避免由激發(fā)光產(chǎn)生的動(dòng)物皮毛,組織和糞便的自發(fā)熒光干擾。Fluc和Rluc的底物分別是熒光素(D-luciferin)和腔腸素(coelentarizine)。前者的熒光波長540～600 nm,組織吸收和散射較少[20],而后者熒光波長460～540 nm,組織吸收多且體內(nèi)代謝快[21]。因此很多活體實(shí)驗(yàn)采用Fluc作為報(bào)告基因,而Rluc作為熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)參照。不僅如此,兩種底物對(duì)胞膜通透性也不一樣,Fluc的水溶性和脂溶性都非常好,易穿透細(xì)胞膜或血腦、胎盤屏障[22～23];而Rluc在胞漿內(nèi)被一種廣譜耐藥糖蛋白MDR1識(shí)別并轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外,因此很難達(dá)到細(xì)胞漿內(nèi)[24]。

1.2.2 生物發(fā)光在病原體研究和感染性疾病中的應(yīng)用:生物發(fā)光技術(shù)可以用來研究大分子、細(xì)胞、細(xì)菌、病毒在機(jī)體內(nèi)的生物學(xué)行為。1995年,Contag等[25]首次采用螢光素酶標(biāo)記沙門氏菌,評(píng)價(jià)了不同亞系菌株在小鼠體內(nèi)的毒力。此后幾十種細(xì)菌被螢光素酶標(biāo)記,以研究感染疾病的發(fā)病機(jī)理和治療反應(yīng)。目前標(biāo)記細(xì)菌主要采用兩種策略,一種是直接將Lux操縱子插入細(xì)菌染色體中,但這種方法不能運(yùn)用于高等生物。另一種方法將螢光素酶編碼基因插入病原菌染色體,然后宿主動(dòng)物全身給予底物,此法應(yīng)用最為廣泛。發(fā)光菌Lux基因操縱子和海腎螢光素酶產(chǎn)生的熒光波長都在500 nm左右。而螢火蟲螢光素酶產(chǎn)生的熒光波長在600 nm左右。使用合適的波長濾光器即可區(qū)分這兩種波長熒光,從而達(dá)到同時(shí)對(duì)多種報(bào)告基因定位和定量。Hutchens等[26]嘗試了兩種螢光素酶同時(shí)顯像。他們在全身表達(dá)Fluc的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)注入帶有Lux操縱子的肺炎鏈球菌,觀察了細(xì)菌在或體內(nèi)的致病和治療反應(yīng)。螢光素酶還可以和綠色熒光蛋白或PET報(bào)告蛋白結(jié)合顯像。Yaghoubi等[27]用螢光素酶和熒光蛋白、PFT報(bào)告蛋白共標(biāo)記Ⅱ型膠原特異性T細(xì)胞,并觀察了這種關(guān)節(jié)炎與膠原的關(guān)聯(lián)特征。以IRES連接后融合表達(dá)的雙報(bào)告基因一般都有 IRES下游報(bào)告基因表達(dá)衰減傾向。Wang[28]等人用十個(gè)串聯(lián)的同源結(jié)構(gòu)域蛋白修飾IRES(SIRES),并用此SIRES鏈接螢光素酶和PET報(bào)告基因,發(fā)現(xiàn)SIRES下游PET報(bào)告基因的表達(dá)大大增強(qiáng)。Venisnik等[29]還將螢光素酶融合到抗癌胚抗原(CEA)抗體上在活體內(nèi)針對(duì)CEA陽性腫瘤達(dá)到非常精細(xì)的成像。

1.2.3 生物發(fā)光在腫瘤研究中的應(yīng)用:生物發(fā)光在腫瘤研究中最直接的應(yīng)用是將螢光素酶基因體外標(biāo)記腫瘤細(xì)胞,再經(jīng)皮下成瘤、或原位移植瘤,觀察原發(fā)腫瘤的血管侵襲、遷移等一系列生物特征。螢光素酶也可以和熒光蛋白聯(lián)合應(yīng)用,分別標(biāo)記不同細(xì)胞在同一活體內(nèi)顯像,或標(biāo)記同種細(xì)胞不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。根據(jù)發(fā)光是否與底物導(dǎo)入有關(guān)將兩種報(bào)告基因區(qū)分開。Edinger等[30]將螢光素酶和熒光蛋白同時(shí)標(biāo)記的淋巴瘤細(xì)胞植入小鼠后觀察了其在體內(nèi)的定殖,擴(kuò)張,轉(zhuǎn)移,以及其對(duì)放療,化療和免疫治療的反應(yīng)。他們還將NK-T細(xì)胞標(biāo)記并觀察了其進(jìn)入并殺傷腫瘤組織的全過程。Catherine等[31]將GFP和螢光素酶同時(shí)標(biāo)記的小鼠肝癌模型,并對(duì)myc癌基因進(jìn)行失活,觀察到失活myc后肝癌細(xì)胞向正常干細(xì)胞分化并開始表達(dá)正常干細(xì)胞的標(biāo)志物。再激活myc后細(xì)胞又轉(zhuǎn)向癌細(xì)胞分化。Stathopoulos等[32]用綠色熒光蛋白和螢光素酶雙報(bào)告基因標(biāo)記的lewis肺癌細(xì)胞靜脈注射小鼠,發(fā)現(xiàn)體外檢測到的肺部熒光強(qiáng)度和肺表面癌胞數(shù)成正相關(guān)。他們還將這種lewis肺癌細(xì)胞直接注射到小鼠胸膜內(nèi),活體觀察了小鼠的胸腔積液特點(diǎn)。

螢光素酶的缺點(diǎn)主要表現(xiàn)在底物的導(dǎo)入對(duì)設(shè)備和技術(shù)的要求。其次是螢光素酶催化底物發(fā)生的反應(yīng)是需氧反應(yīng),因此在缺氧組織的報(bào)告基因多有失真現(xiàn)象。Cecic等曾就此將螢光素酶與lacZ報(bào)告系統(tǒng)在缺氧腫瘤組織中做過對(duì)比[33],發(fā)現(xiàn)缺氧組織中螢光素酶報(bào)告存在失真現(xiàn)象。

2 幾種相關(guān)技術(shù)

2.1 CCD相機(jī)與小動(dòng)物整體成像

目前使用的活體小動(dòng)物整體成像設(shè)備多使用背部薄化、背照射的冷CCD照相機(jī)(charge coupled device cameras)[34]。CCD技術(shù)上分為前照射和背照射。前照射型在光信號(hào)和CCD芯片之間有一層多硅層和二氧化硅層,減少了CCD的量子效率,光信號(hào)衰減而小于理論值。而背部薄化、背照射的冷CCD照相機(jī)(back-thinned and backilluminated)將多硅層和二氧化硅層去掉,能夠檢查到深層活體組織發(fā)出的極為微弱的熒光。但同時(shí)提高了成本,也失去了多硅層和二氧化硅層對(duì)于芯片的保護(hù)作用。因此一般體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)都使用前照射CCD,只有在整體動(dòng)物成像或?qū)O微弱熒光成像時(shí)才采用背照射。

小動(dòng)物整體熒光成像時(shí),動(dòng)物被麻醉后放置在絕對(duì)密閉暗箱內(nèi)的可調(diào)平臺(tái)上。在普通光照下拍攝一次背景照片,再用CCD拍攝熒光圖像。軟件疊加后得到整體小動(dòng)物體內(nèi)的熒光圖像。如果對(duì)于某些部位的熒光有較高的分辨率和精細(xì)度要求,則打開一個(gè)外科的體表皮瓣窗(skin-flap window)以減小熒光從組織到達(dá)探頭的距離,提高檢出的熒光強(qiáng)度。針對(duì)熒光蛋白的小動(dòng)物整體成像責(zé)需要激發(fā)光發(fā)生器及濾波器,發(fā)射光濾波器和CCD探頭組成。對(duì)于不同的熒光蛋白,不同波長的激發(fā)光經(jīng)過濾波器照射到動(dòng)物活體組織,激發(fā)的發(fā)射光又經(jīng)可調(diào)波長的發(fā)射濾波器后到達(dá)探頭。激發(fā)光裝置一再簡化,目前甚至最簡單的LED閃光燈都可以用于熒光蛋白的整體成像[35]。最近應(yīng)用的光譜顯像(spectral imaging)是一種能夠?qū)⒆园l(fā)熒光和標(biāo)記熒光分辨開來的顯像模式。在常規(guī)光學(xué)鏡頭前加一個(gè)低溫單色攝像頭和液晶可調(diào)濾光器。然后從500到650nm發(fā)射光波譜每10 nm取一張圖,按順序排列為光譜序列圖,用軟件將這些光譜序列圖和RFP或GFP自發(fā)熒光光譜進(jìn)行對(duì)照分析后可以得到光譜圖像[7]。這種光譜顯像最為顯著的優(yōu)點(diǎn)是大大減小了皮毛和組織自發(fā)熒光的干擾。目前常用的整體/顯微多用途熒光成像系統(tǒng)有OV100(Olympus Optical,德國),eXplore Optix(NIR)系統(tǒng)(General Electrics Healthcare,加拿大),和 Xenogen IVIS系統(tǒng)(Xenogen Corporation,Hopkinton,美國),MaestroTM系統(tǒng)(Cambridge Research&Instrumentation,CRI)[36]。Alencar等[51]開發(fā)了一種針尖物鏡頭深入到組織內(nèi)部。其時(shí)間,空間和波長分辨率都很好。hoffman等用這種配備針尖物鏡的激光顯微鏡對(duì)活體內(nèi)細(xì)胞成像,觀察到高度清晰的腫瘤細(xì)胞和宿主細(xì)胞相互作用的顯微圖片[37]。

2.2 多光子成像技術(shù)

多光子顯微鏡是近年來應(yīng)用最廣泛的活體弱熒光檢測技術(shù)。單光子激發(fā)情況下,激發(fā)光多需要紫外光。雙光子激發(fā)時(shí)采用兩個(gè)紅外光子同時(shí)激發(fā)熒光基團(tuán)。這種長波的激發(fā)光能夠很好的穿透組織且損傷極小,提高了活體顯像的體層深度,延長了活體樣本的耐受時(shí)間。此外,雙光子熒光激發(fā)只發(fā)生在焦點(diǎn)平面,減少了焦點(diǎn)外的偽影干擾。降低紫外光用量也降低了對(duì)光學(xué)元件的限制[38]。綜合起來,雙光子顯微鏡具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)[39]:①具有高空間局域性和高分辨率;②雙光子激發(fā)的發(fā)射熒光波長遠(yuǎn)離激發(fā)波長,避免了激發(fā)光對(duì)發(fā)射光的干擾,能實(shí)現(xiàn)暗場成像。同時(shí)散射產(chǎn)生的背景噪聲小,圖像對(duì)比度高;③焦點(diǎn)以外不發(fā)生光漂白現(xiàn)象;④激發(fā)光源采用紅外光,能對(duì)生物組織的深層成像。

同一種熒光基團(tuán)在吸收單個(gè)光子和吸收雙光子的情況下激發(fā)情況不同。有的基團(tuán)在吸收單光子時(shí)不發(fā)出熒光而在吸收雙光子時(shí)發(fā)出熒光。因此通過控制體外激發(fā)光波長可以達(dá)到對(duì)體內(nèi)特定的熒光基團(tuán)進(jìn)行光控開關(guān)[40]。這種激發(fā)光控制分子熒光開關(guān)技術(shù)用于活體熒光顯像,可以獲得焦平面15 nm的分辨率,對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)很好分辨率。極低的組織損傷使得很多瞬時(shí)的生物過程得以長時(shí)觀察。如腎濾過[41],膠質(zhì)細(xì)胞突觸形成[42],免疫系統(tǒng)[43],鈣質(zhì)代謝[44]等。

2.3 活體的斷層熒光成像與三維熒光重建

在某種均一生物組織中,體層內(nèi)部熒光穿過組織細(xì)胞時(shí)都有一定的吸收。在體表探測到的熒光衰減的量,和組織厚度密度成正比。由此根據(jù)一定的算法就可以得出體表某一點(diǎn)熒光的實(shí)際體層深度。把各點(diǎn)的深度得出后就可以得到動(dòng)物各個(gè)體層的熒光斷層圖像(fluorescence molecular tomography,FMT)[45-46]。這種三維熒光活體成像技術(shù)至少需要三項(xiàng)參數(shù):測量組織的光學(xué)特性;預(yù)測特定光源下模型動(dòng)物體表的光強(qiáng)度分布特點(diǎn);軟件重建組織深度和熒光能量。該技術(shù)最初只能在非生物的假動(dòng)物模型中模擬,Zacharakis等[47]首次使用活體小鼠進(jìn)行了三維活體顯像。Comsa等[48]用擴(kuò)散近似值法先從普通活體熒光成像中獲得兩種圖像:一種反射圖像來得到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織光學(xué)特性,一種熒光發(fā)射圖像來重建組織深度和熒光能量。使用同樣方法他們在處死后小鼠體內(nèi)植入的點(diǎn)光源進(jìn)行了熒光三維重建[49]。最初的熒光活體三維重建技術(shù)都是基于理想化的密度均一組織,Virostko等[50]將點(diǎn)光源植入小鼠腹腔,首次研究了非均質(zhì)組織的光學(xué)特性和三維熒光重建的準(zhǔn)確率。Alexandrakis等[51]用 PET先對(duì)小鼠作高清晰的立體解剖圖,將各層光學(xué)特性用PET數(shù)據(jù)記載下來。精確計(jì)算了熒光在各層組織中的衰減率,同時(shí)可以測算特定深度所需的最低組織光學(xué)特性精確度。也可以先用多角度結(jié)構(gòu)光將小鼠表面立體重建,彌散近似法計(jì)算熒光的組織衰減。這種方法對(duì)單次成像成像的表面熒光圖像重建后可以獲得高度清晰的3-D熒光圖像[52]。這種方法已經(jīng)在小鼠前列腺腫瘤細(xì)胞活體三維成像中得到應(yīng)用。Garofalakis等[53]用旋轉(zhuǎn)的載物架和CCD相機(jī)得到不同旋轉(zhuǎn)位置的小鼠體內(nèi)熒光圖像,軟件重建之后將小鼠脾內(nèi)3×105個(gè)表達(dá)綠色熒光蛋白的T淋巴細(xì)胞團(tuán)立體顯影。Montet等[54]將小鼠體內(nèi)熒光標(biāo)記的大腸癌腫瘤血管進(jìn)行體層顯像,觀察到了各種促血管信號(hào)通路阻斷后對(duì)血管生成的影響,以及抗血管生成治療手段的療效。Huang[55]最近發(fā)表在Science上的文章報(bào)道了一種稱為STORM(stochastic optical reconstruction microscopy)的3D熒光顯微系統(tǒng)[55]。這種系統(tǒng)可以達(dá)到最高平面分辨率為20～30 nm,軸向分辨率50～60 nm。基本可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)部熒光基團(tuán)進(jìn)行立體顯像。目前不管是宏觀的還是微觀的立體顯微鏡都不能對(duì)或體內(nèi)的生物現(xiàn)象進(jìn)行長時(shí)觀察。Vinegoni等[56]在Nature上報(bào)道了一種介觀(mesoscopic)顯微系統(tǒng)。能夠在介于宏觀和微觀之間(納米和毫米之間)對(duì)果蠅蛹的形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行長時(shí)間熒光斷面和立體成像,觀察其生長發(fā)育和對(duì)環(huán)境藥物等刺激的反應(yīng)。

基因和蛋白質(zhì)功能的研究,各種信號(hào)通路、腫瘤靶向技術(shù)和免疫機(jī)理研究都離不開生物的活體環(huán)境?；铙w熒光成像相關(guān)的一系列技術(shù)目前致力于擴(kuò)大標(biāo)記靶標(biāo)的范圍、增加檢測的敏感性、減小報(bào)告子對(duì)活體環(huán)境的干擾、提高對(duì)活體環(huán)境的模擬水平。隨著DNA及蛋白質(zhì)靶向技術(shù),三維熒光技術(shù)、多光子技術(shù)的逐漸成熟,整體活動(dòng)物內(nèi)的細(xì)胞分子水平研究已經(jīng)取代了離體的、無生命的研究時(shí)代。在弱熒光檢測硬件的推動(dòng)下,活體生物內(nèi)部世界更多秘密將會(huì)被我們用眼睛看到。

[1]Chalfie M,Tu Y,Euskirchen G,et al.Green fluorescent protein as a marker for gene expression[J].Science,1994,263:802.

[2]Hoffman R M.The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo[J].Nat Rev Cancer,2005,5:796.

[3]Matz M V,Fradkov A F,Labas Y A,et al.Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species[J].Nat Biotechnol,1999,17:969.

[4]Shaner N C,Campbell R E,Steinbach P A,et al.Improved monomeric red,orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp.red fluorescent protein[J].Nat Biotechnol,2004,22:1567.

[5]Hoffman R M.A better fluorescent protein for whole-body imaging[J].Trends Biotechnol,2008,26:1.

[6]Hoffman R M.Recent advances on in vivo imaging with fluorescent proteins[J].Methods Cell Biol,2008,85:485.

[7]Hoffman R M.Imaging tumor angiogenesis with fluorescent proteins[J].APMIS,2004,112:441.

[8]Yamauchi K,Yang M,Jiang P,et al.Development of real-time subcellular dynamic multicolor imaging of cancer-cell trafficking in live mice with a variable-magnification whole-mouse imaging system[J].Cancer Res,2006,66:4208.

[9]Hayashi K,Jiang P,Yamauchi K,et al.Real-time imaging of tumor-cell shedding and trafficking in lymphatic channels[J].Cancer Res,2007,67:8223.

[10]Yang M,Jiang P,Sun F X,et al.A fluorescent orthotopic bone metastasis model of human prostate cancer[J].Cancer Res,1999,59:781.

[11]Gerald N J,Coppens I,Dwyer D M.Molecular characterization and expression of a novel kinesin which localizes with the kinetoplast in the human pathogen,Leishmania donovani[J].Cell Motil Cytoskeleton,2008,65:269.

[12]Hayashi K,Yamauchi K,Yamamoto N,et al.Dual-color imaging of angiogenesis and its inhibition in bone and soft tissue sarcoma[J].J Surg Res,2007,140:165.

[13]Amoh Y,Nagakura C,Maitra A,et al.Dual-color imaging of nascent angiogenesis and its inhibition in liver metastases of pancreatic cancer[J].Anticancer Res,2006,26:3237.

[14]Amoh Y,Bouvet M,Li L,et al.Visualization of nascent tumor angiogenesis in lung and liver metastasis by differential dual-color fluorescence imaging in nestin-linked-GFP mice[J].Clin Exp Metastasis,2006,23:315.

[15]Yamamoto N,Yang M,Jiang P,et al.Color coding cancer cells with fluorescent proteins to visualize in vivo cellular in-teraction in metastatic colonies[J].Anticancer Res,2004,24:4067.

[16]Tsui L V,Kelly M,Zayek N,et al.Production of human clotting Factor IX without toxicity in mice after vascular delivery of a lentiviral vector[J].Nat Biotechnol,2002,20:53.

[17]Germain R N,Castellino F,Chieppa M,et al.An extended vision for dynamic high-resolution intravital immune imaging[J].Semin Immunol,2005,17:431.

[18]Iyer M,Sato M,Johnson M,et al.Applications of molecular imaging in cancer gene therapy[J].Curr Gene Ther,2005,5:607.

[19]McCaffrey A,Kay M A,Contag C H.Advancing molecular therapies through in vivo bioluminescent imaging[J].Mol Imaging,2003,2:75.

[20]Paroo Z,Bollinger R A,Braasch D A,et al.Validating bioluminescence imaging as a high-throughput,quantitative modality for assessing tumor burden[J].Mol Imaging,2004,3:117.

[21]Bhaumik S,Gambhir S S.Optical imaging of Renilla luciferase reporter gene expression in living mice[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2002,99:377.

[22]Luker G D,Bardill J P,Prior J L,et al.Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice[J].J Virol,2002,76:12149.

[23]Lipshutz G S,Gruber C A,Cao Y,et al.In utero delivery of adeno-associated viral vectors:intraperitoneal gene transfer produces long-term expression[J].M ol Ther,2001,3:284.

[24]Pichler A,Prior J L,Piwnica-Worms D.Imaging reversal of multidrug resistance in living mice with bioluminescence:MDR1 P-glycoprotein transports coelenterazine[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101:1702.

[25]Contag C H,Contag P R,Mullins J I,et al.Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts[J].Mol Microbiol,1995,18:593.

[26]Hutchens M,Luker G D.Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases[J].Cell Microbiol,2007,9:2315.

[27]Yaghoubi S S,Creusot R J,Ray P,et al.Multimodality imaging of T-cell hybridoma trafficking in collagen-induced arthritic mice:image-based estimation of the number of cells accumulating in mouse paws[J].J Biomed Opt,2007,12:64025.

[28]Wang Y,IyerM,Annala A J,et al.Noninvasive monitoring of target gene expression by imaging reporter gene expression in living animals using improved bicistronic vectors[J].J Nucl Med,2005,46:667.

[29]Venisnik K M,Olafsen T,Gambhir S S,et al.Fusion of Gaussia luciferase to an engineered anti-carcinoembryonic antigen(CEA)antibody for in vivo optical imaging[J].Mol Imaging Biol,2007,9:267.

[30]Edinger M,Cao Y A,Verneris M R,et al.Revealing lymphoma growth and the efficacy of immune cell therapies using in vivo bioluminescence imaging[J].Blood,2003,101:640.

[31]Shachaf C M,Kopelman A M,Arvanitis C,et al.M YC inactivation uncovers pluripotent differentiation and tumour dormancy in hepatocellular cancer[J].Nature,2004,431:1112.

[32]Stathopoulos G T,Zhu Z,Everhart M B,et al.Nuclearfactor-kappaB affects tumor prog ression in a mouse model of malignant pleural effusion[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2006,34:142.

[33]Cecic I,Chan D A,Sutphin P D,et al.Oxygen sensitivity of reporter genes:implications for preclinical imaging of tumor hypoxia[J].M ol Imaging,2007,6:219.

[34]Rice BW,Cable M D,Nelson M B.In vivo imaging of light-emitting probes[J].J Biomed Opt,2001,6:432.

[35]Yang M,Luiken G,Baranov E,et al.Facile whole-body imaging of internal fluorescent tumors in mice with an LED flashlight[J].Biotechniques,2005,39:170.

[36]Wessels J T,Busse A C,Mahrt J,et al.In vivo imaging in experimental preclinical tumor research-a review[J].Cytometry A,2007,71:542.

[37]Yang M,Jiang P,Hoffman R M.Whole-body subcellular multicolor imaging of tumor-host interaction and drug response in real time[J].Cancer Res,2007,67:5195.

[38]Rocheleau J V,Piston D W.Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.Curr Protoc Cell Bio,2003,Chapter 4:Unit 411.

[39]Imanishi Y,Lodowski K H,Koutalos Y.Two-photon microscopy:shedding light on the chemistry of vision[J].Biochemistry,2007,46:9674.

[40]Folling J,Belov V,Riedel D,et al.Fluorescence nanoscopy with optical sectioning by two-photon induced molecular switching using continuous - wave lasers[J].Chemphyschem,2008,9:321.

[41]Ashworth S L,Sandoval R M,Tanner G A,et al.Twophoton microscopy:visualization of kidney dynamics[J].Kidney Int,2007,72:416.

[42]Nishida H,Okabe S.Visualization of synapse-glia dynamics[J].Brain Nerve,2007,59:755.

[43]Bajenoff M,Germain R N.Seeing is believing:a focus on the contribution of microscopic imaging to our understanding of immune system function[J].Eur J Immunol,2007,37 Suppl 1:S18.

[44]Kim H M,Kim B R,An M J,et al.Two-photon fluorescent probes for long-term imaging of calcium waves in live tissue[J].Chemistry,2008,14:2075.

[45]M eyer H,Garofalakis A,Zacharakis G,et al.Noncontact optical imaging in mice with full angular coverage and automatic surface extraction[J].Appl Opt,2007,46:3617.

[46]McCormack E,Micklem D R,Pindard L E,et al.In vivo optical imaging of acute myeloid leukemia by green fluorescent protein:time-domain autofluorescence decoupling,fluorophore quantification,and localization[J].Mol Imaging,2007,6:193.

[47]Zacharakis G,Ripoll J,Weissleder R,et al.Fluorescent protein tomography scanner for small animal imaging[J].IEEE T rans Med Imaging,2005,24:878.

[48]Comsa D C,Farrell T J,Patterson M S.Quantification of bioluminescence images of point source objects using diffusion theory models[J].Phys M ed Biol,2006,51:3733.

[49]Comsa D C,Farrell T J,Patterson M S.Bioluminescence imaging of point sources implanted in small animals post mortem:evaluation ofa method forestimating source strength and depth[J].Phys Med Biol,2007,52:5415.

[50]Virostko J,Powers A C,Jansen E D.Validation of luminescent source reconstruction using single-view spectrally resolved bioluminescence images[J].Appl Opt,2007,46:2540.

[51]Alexandrakis G,Rannou F R,Chatziioannou AF.Effect of optical property estimation accuracy on tomographic bioluminescence imaging:simulation of a combined optical-PET(OPET)system[J].Phys Med Biol,2006,51:2045.

[52]Kuo C,Coquoz O,Troy T L,et al.Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging[J].J Biomed Opt,2007,12:24007.

[53]Garofalakis A,Zacharakis G,Meyer H,et al.Three-dimensional in vivo imaging of green fluorescent protein-expressing T cells in mice with noncontact fluorescence molecular tomography[J].Mol Imaging,2007,6:96.

[54]Montet X,Figueiredo J L,Alencar H,et al.Tomographic fluorescence imaging of tumor vascular volume in mice[J].Radiology,2007,242:751.

[55]Huang B,Wang W,Bates M,et al.Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy[J].Science,2008,319:810.

[56]Vinegoni C,Pitsouli C,Razansky D,et al.In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomog raphy[J].Nat Methods,2008,5:45.