陳吉祥,陳明軍,張尤歷

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇鎮(zhèn)江 212001)

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),人染色體 3p21.3等位缺失與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)[1],該位點(diǎn)存在腫瘤抑制基因 RASSF1基因家族[2,3]。該家族至少包含 7種不同的轉(zhuǎn)錄本(轉(zhuǎn)錄本A～G)。RASSF1B基因在腫瘤組織和正常組織中都有表達(dá),但其功能尚沒(méi)有明確[4]。本研究采用 RT-PCR結(jié)合生物信息學(xué)方法對(duì)胃癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞中的 RASSF1B基因進(jìn)行了克隆及序列分析。

1 材料與方法

1.1 材料 5株腫瘤細(xì)胞分別為胃腺癌細(xì)胞 AGS、肝癌細(xì)胞 HEPG2、高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞 95D、肺腺癌細(xì)胞LTEP-a-2、白血病細(xì)胞U937。MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒等。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將上述 5種腫瘤細(xì)胞分別加DMEM及 10%小牛血清,置 CO2培養(yǎng)箱中 37℃培養(yǎng)至細(xì)胞均勻覆蓋細(xì)胞瓶約 3/4。

1.3 RNA的提取、擴(kuò)增及克隆 以 Trizol提取上述各種細(xì)胞的總RNA并純化,用MMLV反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。利用DNAstar軟件設(shè)計(jì) RASSF1B基因的特異引物,擴(kuò)增引物為 5′-ATG AGC TTG AAC AAG GAC GG-3′(上游引物)、5′-TCC ACC TGG GGG TAC AAGAGG-3′(下游引物),擴(kuò)增長(zhǎng)度為 591 bp。以人β-actin作內(nèi)參照,引物序列為 5′-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3′(上游引物)、5′-GGC GTA CAG GTC TTT GCG GAT G-3′(下游引物),擴(kuò)增長(zhǎng)度為 512 bp。PCR反應(yīng)條件:95℃、2 min,94℃、15 s,58℃、30 s,72℃、1.5 min,30個(gè)循環(huán),72℃、10 min。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR產(chǎn)物。將RASSF1B的 PCR產(chǎn)物連接到 T-載體上,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中,經(jīng)藍(lán)白斑篩選出陽(yáng)性克隆。

1.4 RASSF1B基因的序列分析 應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析。

2 結(jié)果

分別提取了 5株腫瘤細(xì)胞的總 RNA。凝膠電泳結(jié)果顯示,28 S和 18 S條帶較為明顯,RNA的完整性和質(zhì)量較好。核酸檢測(cè)儀檢測(cè)顯示A260/A280均在 1.9～2.0,與電泳結(jié)果一致。

經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后,RASSF1B在 5種腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá),其中在肺腺癌細(xì)胞株LTEP-a-2和白血病細(xì)胞株 U937中的表達(dá)量較高,在其他三種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量較少。肺腺癌細(xì)胞株LTEP-a-2、白血病細(xì)胞株U937、胃腺癌細(xì)胞株 AGS、高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株 95 D、肝癌細(xì)胞株 HEPG2的 RASSF1B mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為 0.62、0.71、0.07、0.22、0.13。

將RASSF1B的 PCR產(chǎn)物連接到 T-載體上,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中,經(jīng)藍(lán)白斑篩選出陽(yáng)性克隆。測(cè)序結(jié)果表明克隆后的基因全長(zhǎng)為 591 bp,其中編碼區(qū)為 570 bp,編碼 189個(gè)氨基酸,與網(wǎng)上登錄RASSF1B一致 (Genbank序列號(hào):NM_170712)。應(yīng)用生物學(xué)軟件 ExPASy Proteomics Server對(duì)其進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,RASSF1B基因含有一個(gè) Ras結(jié)合區(qū)域(45～139 aa)和一個(gè) SARAH區(qū)域 (143～189 aa)。

3 討論

RASSF1家族是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的,目前的研究表明,其不同的轉(zhuǎn)錄剪切本在惡性腫瘤的發(fā)生和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用,它們能夠直接參與細(xì)胞周期的調(diào)控。但其作用機(jī)理尚未明確。

有研究表明,在一些基因家族中,各轉(zhuǎn)錄本之間存在協(xié)調(diào)表達(dá),一旦表達(dá)平衡被打破,就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞不正常增殖[5]。因此,在不同的細(xì)胞系中分析各轉(zhuǎn)錄本表達(dá)比例的變化可以初步推斷各轉(zhuǎn)錄本與腫瘤發(fā)生間的關(guān)系。由于RASSF1家族的轉(zhuǎn)錄本A在正常和癌變的組織中表達(dá)差異明顯,故研究較多。其轉(zhuǎn)錄本B在腫瘤組織和正常組織中表達(dá)差異不大,被普遍認(rèn)為是沒(méi)有特殊生物學(xué)功能的基因,一直沒(méi)有受到重視。本研究采用 RT-PCR方法,在 5種腫瘤細(xì)胞中擴(kuò)增出 RASSF1基因,進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)在不同的癌變細(xì)胞系中,RASSF1B雖都有表達(dá),但表達(dá)量存在明顯的差異,在肺癌細(xì)胞系及白血病細(xì)胞系中表達(dá)量高。而在這幾種腫瘤細(xì)胞系中并未明顯地?cái)U(kuò)增出轉(zhuǎn)錄本 A的片段,提示 RASSF1B的表達(dá)量可能與腫瘤的類(lèi)型有關(guān),其在不同種類(lèi)的癌變細(xì)胞中所起的作用可能不同。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),RASSF1B含有一個(gè) Ras結(jié)合區(qū)域和一個(gè) SARAH區(qū)域。Ras區(qū)域是該家族共有的區(qū)域。Ras通路是所有細(xì)胞都具有的一條高度保守的信號(hào)傳遞通路。Ras蛋白在有活性的 GTP結(jié)合構(gòu)象和無(wú)活性的 GDP結(jié)合構(gòu)象之間轉(zhuǎn)化,與不同的效應(yīng)物分子激活多條信號(hào)傳遞通路。有文獻(xiàn)[6]報(bào)道,RASSF1B是通過(guò) Ras區(qū)域以 GTP方式直接與Ha-Ras相結(jié)合。SARAH區(qū)域可以調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]?；罨腞as蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的作用,RASSF1B基因可能通過(guò) GTP方式直接與Ha-Ras相結(jié)合,通過(guò)抑制 Ras的激活途徑而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡;RASSF1B能通過(guò)阻斷 Cyclin D1的積累及細(xì)胞周期 G1/S期的進(jìn)展而抑制腫瘤生長(zhǎng)[8]。需進(jìn)一步通過(guò) RNA干擾等方法,抑制RASSF1B基因的表達(dá),然后分析細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),以明確該基因與細(xì)胞增殖間的關(guān)系。

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