胡光源 趙 峰 張宏福 鐘永興 劉震坤

（中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所,動物營養(yǎng)學國家重點實驗室,北京 100193）

長期以來,人們對豬飼料模擬消化方法的研究,大多以一定濃度的胰液素溶液來模擬豬小腸液,這種研究思路一方面使模擬小腸液缺乏生物學依據(jù),另一方面也使得模擬的腸液難以標準化。因此,要實現(xiàn)對豬小腸液的有效模擬,首先需要了解腸道食糜所處的環(huán)境,即小腸液的組成成分。研究表明,飼糧能量來源（大麥、小麥、淀粉等）及纖維水平與組成對生長豬空腸食糜、胰腺組織的消化酶活性無顯著影響[1-6]。在以家禽作為研究對象的試驗中也表明飼糧能量水平對雞、鴨腸液的組成影響較少,但飼糧蛋白質(zhì)來源對腸液消化酶活性及部分離子濃度有一定的影響[7-9]。在豬的飼糧配制中,能量飼料的種類與數(shù)量相對固定,而蛋白質(zhì)飼料變異較為廣泛,不同餅粕類飼料的有效氨基酸組成、抗營養(yǎng)因子和毒素等可能對生長豬的膽汁、胰液及腸液的分泌有顯著影響,從而影響小腸液的消化酶活性。為了使模擬豬腸液組成的基本參數(shù)不脫離一般生產(chǎn)條件下的變異范圍,本試驗設計了4種不同蛋白質(zhì)來源與水平的飼糧,研究飼糧蛋白質(zhì)來源與水平對生長豬空腸液組成的影響,為豬飼料養(yǎng)分生物學效價酶學評定方法中模擬腸液的設計提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及動物飼養(yǎng)管理

采用4×4拉丁方設計,在8頭體重（22.77± 0.23）kg的杜×長×大三元雜交去勢公豬體內(nèi)安裝空腸T型瘺管,術后按常規(guī)程序護理3周,期間飼喂基礎飼糧。待試驗豬恢復后,從荷術豬中挑選健康、體重（27.79±0.46）kg的4頭試驗豬進行試驗。試驗豬分期、分號分別飼喂4種試驗飼糧,即玉米-豆粕型飼糧（飼糧1）、玉米-豆粕低蛋白質(zhì)飼糧（飼糧2）、玉米-豆粕-棉籽粕-菜籽粕飼糧（飼糧3）和玉米-豆粕-棉籽粕-菜籽粕低蛋白質(zhì)飼糧（飼糧4）。每期試驗為15 d,其中預試期10 d,在試驗期第11天、第13天和第15天每天的09:30、13:30和17:30采集食糜樣品1 h。整個試驗期間荷術豬自由飲水,每天08:00和16:00拌濕喂料,采食量控制為試驗豬體重的4%。代謝室衛(wèi)生管理按動物營養(yǎng)學國家重點實驗室常規(guī)程序進行。

1.2試驗飼糧

參照NRC（1998）生長豬營養(yǎng)需要量,將飼糧蛋白質(zhì)含量設置為（20～50）kg和（51～80）kg豬蛋白質(zhì)需要量的平均值,低蛋白質(zhì)飼糧為該平均值的85%。預混料使用1%生長豬預混料。試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎）Table 1 Composition and nutrient levels o f experimen tal diets（air-dry basis）%

1.3 空腸瘺管安裝及術后護理

術前試驗豬禁食24 h,期間自由飲水。手術室及手術器材消毒后,將試驗豬右腹側(cè)后半部剃毛、清潔。試驗豬耳后注射麻醉劑進行全身麻醉。按瘺管安裝常規(guī)操作,在腹中線上方約20 cm、最后肋骨后3～4 cm處,縱向做長6～8 cm的切口,于空腸前段（離幽門后170 cm）即空腸靠近腸系膜淋巴結(jié)末端的腸段上安裝T型瘺管,并于皮膚切口距頭側(cè)約5 cm處做一切口,由此將漏管管體部引出,勿使腸管發(fā)生前后扭轉(zhuǎn),用硅膠螺母片固定瘺管管體部,按照常規(guī)進行腹腔及皮膚縫合并做消炎處理。術后將荷術豬轉(zhuǎn)移至安靜房間,待其完全清醒后轉(zhuǎn)移至代謝籠內(nèi),禁飼禁水24 h,按常規(guī)護理程序護理并恢復3周,當試驗豬恢復了正常的采食并且體況保持穩(wěn)定后,開始試驗期。

1.4 樣品采集與制備

每期試驗的第11天、第13天和第15天每天的09:30、13:30、和17:30通過有低溫保鮮（0～4℃）效果的自制收集瓶,從瘺管口處采集50 m L空腸食糜樣品,每次采樣結(jié)束后立刻混勻取部分樣品轉(zhuǎn)入10 m L離心管中,4℃1 250 g離心10 min。取上清液旋渦混合后分裝成8等份,儲存于-70℃冰箱保存,待測酶活和離子濃度。

1.5 測定指標及方法

測定樣品時,將第11天、第13天和第15天采樣期樣品按早、中、晚時間點于4℃冷水浴中解凍后充分混合,以緩沖液（消化酶測定）或去離子水（離子濃度測定）稀釋至所需倍數(shù)。α-淀粉酶以可溶性淀粉為底物測定活性[10],淀粉酶活性單位定義為25℃、pH 6.90條件下每m in釋放1μm ol麥芽糖所具有的活性;脂肪酶活性使用德國Diasys脂肪酶試劑盒測定,脂肪酶活性單位定義為37℃、pH 8.90條件下每min水解1 nm ol甘油三酯所具有的活性;胰蛋白酶活性測定以甲基叔戊基醚（TAME）為底物進行測定[11],胰蛋白酶活性單位定義為25℃、pH 8.10條件下每m in釋放1μmol對-甲苯磺酞-L-精氨酸時所具有的活性。糜蛋白酶活性以N-苯甲酰-L-酪氨酰乙酯（BTEE）為底物測定,糜蛋白酶活性單位定義為在25℃、pH 7.80條件下每m in釋放1μmol苯甲酞-L-酪氨酸所具有的活性。所有消化酶的活性單位均以U/m L腸液表示。吸光度用TU-1900可控溫雙光束紫外可見分光光度計測定。

空腸液中Na+、K+、Cl-濃度用M edica Corpo rction公司產(chǎn)Easyly te Plus型鈉鉀氯分析儀測定;Mg2+、Ca2+濃度的測定采用英國（Randox） CA 2390、MG531的檢測試劑盒測定;pH用德國Sartorius PB-10酸度計在38℃水浴下測定。

1.6 統(tǒng)計分析

對3 d采樣期早、中、晚空腸液酶活和離子濃度的均值做統(tǒng)計分析,為生長豬每期空腸液消化酶活性及離子濃度變異。

根據(jù)拉丁方設計,采用SAS 8.0的GLM模塊進行方差分析,統(tǒng)計模型為:Y=μ+Ti+Pj+D k+εijkl,μ為總體均數(shù),T為周期效應,P為豬效應,D為飼糧效應,ε為隨機誤差。

用Duncan氏法對均值進行多重比較;以SAS Contrast語句比較飼糧1與飼糧3間、飼糧2與飼糧4間及飼糧1+飼糧3與飼糧2+飼糧4間的差異,顯著水平為P＜0.05,對P＜0.15的處理因素作趨勢分析。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧蛋白質(zhì)來源與水平對生長豬空腸液中主要消化酶活性的影響

從4種飼糧對生長豬空腸液消化酶活性的影響（表2）可知,各飼糧組間空腸液中的胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性無顯著差異（P＞0.05）;通過SAS Contrast語句分別比較正常蛋白質(zhì)水平（飼糧1對飼糧3）和低蛋白質(zhì)水平（飼糧2對飼糧4）飼糧條件下,生長豬空腸液消化酶活性的差異發(fā)現(xiàn),無論是正常蛋白質(zhì)水平還是低蛋白質(zhì)水平條件下,飼糧蛋白質(zhì)來源對空腸液中的胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性均無顯著影響（P＞0.05）;通過SASContrast語句比較正常蛋白質(zhì)水平（飼糧1+飼糧3）與低蛋白質(zhì)水平（飼糧2+飼糧4）條件下,生長豬空腸液酶活的差異發(fā)現(xiàn),飼糧低蛋白質(zhì)水平有提高空腸液中的胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶活性的趨勢（P＜0.15）,而對淀粉酶的活性無顯著影響（P＞0.05）。此外,從拉丁方試驗的試驗期及試驗豬個體間對豬空腸液消化酶活性變異的貢獻看,豬的生長周期（試驗期）對糜蛋白酶的活性有影響的趨勢（P＜0.15）,試驗豬個體間對淀粉酶活性上有顯著差異（P＜0.05）。

2.2 飼糧蛋白質(zhì)來源與水平對生長豬空腸液中主要離子濃度的影響

從4種飼糧處理條件下生長豬空腸液中5種主要離子濃度及pH的差異（表3）看,飼糧因素對生長豬空腸液中5種主要離子的濃度及pH無顯著影響（P＞0.05）;通過SAS Contrast語句分別比較正常蛋白質(zhì)水平（飼糧1對飼糧3）和低蛋白質(zhì)水平（飼糧2對飼糧4）條件下,生長豬空腸液中的離子濃度及pH的差異發(fā)現(xiàn),無論是正常蛋白質(zhì)水平還是低蛋白質(zhì)水平條件下,飼糧蛋白質(zhì)來源對空腸液中的5種主要離子的濃度及pH都無顯著影響（P＞0.05）;通過SAS Contrast語句比較正常蛋白質(zhì)水平（飼糧1+飼糧3）與低蛋白質(zhì)水平（飼糧2+飼糧4）條件下,生長豬空腸液中離子的濃度及pH的差異發(fā)現(xiàn),飼糧蛋白質(zhì)水平對生長豬空腸液中5種主要離子的濃度及pH也無顯著影響（P＞0.05）。此外,從拉丁方試驗的試驗期及試驗豬個體間對空腸液離子濃度變異的貢獻看,豬的生長周期（試驗期）對Mg2+濃度有顯著的影響（P＜0.05）,對Na+濃度有影響趨勢（P＜0.15）,試驗豬個體間在Na+、K+、Cl-、Ca2+的濃度上有顯著差異（P＜0.05）。

表2 飼糧蛋白質(zhì)來源與水平對生長豬空腸液消化酶活性的影響Tab le 2 Ef fects of dietary protein source and level on the digestive enzym e activities of je junal fluid in growing pigs U/m L

表3 飼糧蛋白質(zhì)來源與水平對豬空腸液離子濃度和pH的影響Table 3 Effects o f dietary p rotein source and level on the ion concentration and pH o f jejunal fluid in grow ing pigs

3 討 論

3.1 飼糧蛋白質(zhì)來源及水平與生長豬空腸液組成的關系

胰腺與腸腺分泌的各種酶蛋白是小腸液中消化酶的主要來源。1頭40 kg的生長豬1 d可分泌的消化液平均為2.51 L[6,13],足夠?qū)⒆儺惡艽蟮娘暭Z完全消化[6,14]。由此可見,豬內(nèi)源性消化酶相對于采食量而言是極其過量的。盡管豬腸道環(huán)境的變化（食糜、飲水等）可反饋調(diào)控消化液的分泌,但迷走神經(jīng)在很大范圍內(nèi)可調(diào)節(jié)消化液總分泌量[15],本試驗條件下,4種飼糧的能量飼料以玉米為主,蛋白質(zhì)飼料分別為豆粕、棉籽粕和菜籽粕三者的組合。飼糧的蛋白質(zhì)來源對生長豬空腸液4種主要消化酶活性無顯著影響,這表明豬腸液中主要消化酶對飼料蛋白質(zhì)的來源有較大范圍的適應性,此結(jié)果與前期所報道的豬胰液與消化道酶活性對魚粉、花生粕及酪蛋白等蛋白質(zhì)來源不敏感的結(jié)果類似[1-2]。然而,本試驗中,低蛋白質(zhì)水平飼糧有提高豬空腸液中胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶活性的趨勢,這與前人報道中高蛋白質(zhì)水平飼糧能提高豬胰腺中蛋白酶活性的結(jié)論[13]正好相反,這可能是由于在本試驗中,空腸液來自空腸前段,此處腸液的組成受飲水及非飼糧來源的其他因素干擾較大,至于導致這一結(jié)果的原因仍需進一步研究。

豬腸道內(nèi)電解質(zhì)主要來源于膽汁、胰腺、腸腺的分泌及食糜和飲水。腸道電解質(zhì)是維持機體酸堿平衡、滲透壓平衡的關鍵因素。動物通過腎臟調(diào)節(jié)腸道電解質(zhì)濃度以使電解質(zhì)平衡,維持正常機體代謝[16]。本試驗中,飼糧蛋白質(zhì)來源與水平對生長豬空腸液中5種主要離子濃度都沒有顯著影響,這可能與腸道內(nèi)的水和飼糧源性礦物鹽能很快地被腸道吸收有關[17]。上述結(jié)果也與前人研究豬腸道離子濃度相對穩(wěn)定相一致[3-4,15]。腸液pH是腸道酸堿平衡的綜合反映,動物腸道通過陰陽離子交換有維持pH穩(wěn)定的功能,以此保障腸道的正常消化功能[15]。本試驗條件下,飼糧蛋白質(zhì)來源及水平對生長豬腸道pH沒有顯著影響,這與腸液中存在大量的碳酸鹽緩沖液有關[15],并且飼糧中養(yǎng)分（如蛋白質(zhì)等）的降解產(chǎn)物也能被腸道快速有效地吸收[18-19]。因此,飼糧在腸道中的降解產(chǎn)物對腸液pH的影響很少,從而使得生長豬腸道能維持較穩(wěn)定的pH。

3.2 其他因素與生長豬腸液組成的關系

本試驗中發(fā)現(xiàn)豬的生長周期（試驗期）對Mg2+濃度有顯著影響,而且對糜蛋白酶的活性及Na+濃度有影響趨勢。這表明豬在不同生長階段其腸液的組成是有差異的。然而這種差異是否會導致消化功能的差異仍需要進一步研究。另外,從試驗豬個體對空腸液組成的變異看,不同個體來源的腸液在淀粉酶活性,Na+、K+、Cl-、Ca2+的濃度上有顯著的差異。這可能主要與試驗豬個體在飲水、采食行為、生理狀態(tài)等方面存在差異有關。試驗過程中,我們也發(fā)現(xiàn)不同試驗豬在飲水量、食糜流量上存在較大的差異。

4 結(jié) 論

①飼糧的蛋白質(zhì)來源對生長豬空腸液中胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性及Na+、K+、Cl-、Ca2+、M g2+濃度及pH都沒有顯著影響。

②飼糧的蛋白質(zhì)水平對生長豬空腸液中胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性及Na+、K+、Cl-、Ca2+、M g2+濃度及pH也無顯著影響。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:zhangh f6565@vip.sina.com

（編輯 田艷明）