王秀娜 耿忠誠* 王 燕 劉勝軍 武志敏

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,大慶 163319;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,哈爾濱 150030)

飼糧硒來源及添加水平對仔豬組織中細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶基因mRNA表達(dá)的影響

王秀娜1耿忠誠1*王 燕2劉勝軍1武志敏1

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,大慶 163319;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,哈爾濱 150030)

本文旨在研究飼糧中硒來源及添加水平對仔豬細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶(GPX 1)m RNA表達(dá)的影響,為合理利用各種硒源提供一定的理論基礎(chǔ)。選擇35日齡體重相近的三江白豬仔豬90頭,隨機(jī)分為10組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)3頭豬。分別在9個(gè)試驗(yàn)組飼糧中添加納米硒、酵母硒、亞硒酸鈉,其劑量以硒計(jì),添加量分別為0.1、0.3、0.5m g/kg 3個(gè)水平,對照組飼糧中不另添加硒。試驗(yàn)期為35 d,試驗(yàn)結(jié)束后采用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR技術(shù)測定仔豬肝臟、腎臟、脾臟、肌肉組織中GPX 1 m RNA的表達(dá)量。結(jié)果表明:1)在肝臟組織中,0.5 mg/kg納米硒組GPX 1m RNA表達(dá)量顯著高于亞硒酸鈉組(P＜0.05),0.5mg/kg納米硒組和0.3 mg/kg酵母硒組顯著高于對照組(P＜0.05);2)在腎臟組織中,各試驗(yàn)組之間GPX1 m RNA表達(dá)量差異均不顯著(P＞0.05);3)在脾臟組織中,0.5 mg/kg納米硒組GPX 1m RNA表達(dá)量顯著高于酵母硒組和亞硒酸鈉組(P＜0.05),0.5 mg/kg納米硒組和0.3 mg/kg酵母硒組顯著高于對照組(P＜0.05);4)在肌肉組織中,0.5mg/kg納米硒組GPX 1m RNA表達(dá)量顯著低于亞硒酸鈉組和對照組(P＜0.05)。由此可見,在飼糧中添加0.5 mg/kg納米硒能夠提高仔豬肝臟、脾臟中GPX 1m RNA的表達(dá)量,而肌肉組織中的表達(dá)水平則低于亞硒酸鈉組和對照組。

硒;GPX 1;mRNA

硒是動(dòng)物機(jī)體必需的微量元素之一,與抗氧化密切相關(guān)。硒依賴性的谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)是硒發(fā)揮抗氧化功能的主要形式,能清除組織中有害的過氧化物,保護(hù)生物膜和生物大分子免受氧化損傷[1]。GPX家族主要包括細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶(GPX 1)、胃腸谷胱甘肽過氧化物酶(GPX 2)、血漿谷胱甘肽過氧化物酶(GPX 3)等。其中GPX 1被證明是機(jī)體抗氧化的主要含硒蛋白[2],其活性水平常被用于測定人與動(dòng)物的硒需要量。飼糧中硒水平與GPX 1活性和GPX 1 m RNA調(diào)控有關(guān)[3]。高劑量(0.50 mg/kg)納米硒作為硒源調(diào)控肉雞肝臟組織GPX 1m RNA穩(wěn)定性的能力更強(qiáng)[4],硒蛋白基因在甲狀腺和腦垂體中的表達(dá)不受硒不足或過量的影響[5],這說明硒蛋白在組織中的表達(dá)具有特異性[6]。在生產(chǎn)中為了滿足仔豬健康生長對硒的需要量,在飼糧中通常添加一定量的外源性硒。目前主要以注射劑、粉劑及口服液形式應(yīng)用亞硒酸鈉進(jìn)行補(bǔ)硒,但使用中存在吸收率低、過氧化作用以及有潛在污染等問題[7]。酵母硒是硒富集在生長酵母的細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)生產(chǎn)的有機(jī)硒。納米硒是以蛋白質(zhì)為核,紅色元素硒為膜,蛋白質(zhì)為分散劑的納米粒子,尺寸為20～60 nm。具有較高的生物活性、安全性、抗氧化性和較高的吸收率等特點(diǎn),在動(dòng)物生產(chǎn)中有廣泛的應(yīng)用前景[8]。本試驗(yàn)在仔豬飼糧中分別添加納米硒、酵母硒、亞硒酸鈉,研究不同硒源及添加水平對仔豬不同組織中GPX 1 m RNA表達(dá)量的影響,為合理利用各種硒源提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

選擇35日齡體重相近的三江白仔豬90頭,隨機(jī)分為10組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)3頭豬。分別在9個(gè)試驗(yàn)組飼糧中添加納米硒、酵母硒、亞硒酸鈉,各硒源同配合料倍比稀釋,逐級放大混勻。其劑量以硒計(jì),添加量分別為0.1、0.3、0.5 mg/kg 3個(gè)水平,對照組飼糧中不另添加硒。飼糧以玉米、豆粕為主,參照NRC(1998)標(biāo)準(zhǔn)及中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 65—2004《豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》,配合而成粉狀飼料,飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Tab le 1 Com position and nutrient levels of the experim ental diet(air-d ry basis) %

1.2 樣品采集

試驗(yàn)期為35 d,試驗(yàn)結(jié)束后,每個(gè)重復(fù)屠宰1頭仔豬,取肝臟、腎臟、脾臟、肌肉組織樣,迅速投入液氮中冷凍,-80℃保存。

1.3 GPX1基因mRNA表達(dá)豐度的測定

1.3.1 主要試劑

Trizol總RNA提取試劑盒(Invitrogen),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(東洋紡科技),TaqDNA聚合酶(TaKa-Ra),dNTPMix(TaKaRa),DNA Marker DL 2000(TaKaRa)。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中公布的豬GPX 1(NM 214201)和β-actin(U07786)的基因序列設(shè)計(jì)引物,GPX 1基因上游引物為 5′-CCCACGCTCGGTGTATGCCT-3′,下 游 引 物 為 5′-AGAAAGCGACGGCTGTACCTG-3′,β-actin 內(nèi)參基因上游引物為 5′-CGGGACCTGACCGACTACCT-3′,下游引物為 5′-GGCCGTGACTCCTTCTGC-3′,引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3.3 總RNA提取

按Trizo l總RNA提取試劑盒試驗(yàn)操作步驟提取肝臟、腎臟、脾臟、肌肉組織中的總 RNA,用紫外分光光度計(jì)測定總RNA濃度,并在260和280 nm下測吸光度A值,計(jì)算OD260/OD280的值。此值在1.8～2.0時(shí),表示提取的RNA純度較高,適宜進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.3.4 cDNA的合成

根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟合成cDNA,具體過程如下:RNA 2 μg、Oligo(dT)1 μL,用 RNase Free H 2O補(bǔ)足到12μL,放入65℃水浴鍋5m in,立即置于冰上2～3m in,繼續(xù)向EP管中添加5×RTBuffer 4 μL、dNTP 2 μL、RNase Inhibitor 1 μL、Rever Tra Ace 1μL,然后依次42℃20m in、85℃5m in、4℃5m in,最后瞬間離心,于-20 ℃保存。

恩替卡韋聯(lián)合水飛薊素對乙型病毒性肝炎失代償期肝硬化患者炎癥指標(biāo)及氧化應(yīng)激水平的影響 ……… 李 珂等（1）： 98

1.3.5 PCR

GPX 1和 β-actin基因進(jìn)行同管PCR,25μL反應(yīng)體系為:10×PCR buffer 2.5μL,dNTP 2μL,βactin上游引物(10μm ol/L)0.5μL,β-actin下游引物(10μm)0.5μL,GPX 1上游引物(10μm)0.5μL,GPX 1下游引物(10μm)0.5μL,cDNA 1μL,Tap DNA聚合酶0.2μL,去離子水17.3μL。優(yōu)化最佳退火溫度和最佳循環(huán)數(shù),確定PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5m in,94℃變性30 s,63℃退火30 s,72℃延伸1 m in,31個(gè)循環(huán),72℃延伸10 m in,4℃保存。

1.4 數(shù)據(jù)處理

電泳結(jié)束后,用全自動(dòng)凝膠分析系統(tǒng)拍照,紫外分析系統(tǒng)(Gel-Pro IMAGER 60-2502CE)進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度的分析,計(jì)算各基因條帶的積分光密度(IOD),并以IOD(GPX 1)/IOD(β-actin)的值表示目的基因的相對表達(dá)量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel整理,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SAS 9.0軟件包中的ANOVA程序進(jìn)行方差分析,差異顯著時(shí)采用Duncan氏方法對各組間平均數(shù)進(jìn)行多重比較,以P＞0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 RNA凝膠電泳檢測結(jié)果

由圖1可以看出,3條電泳條帶(28S、18S和5S)清晰整齊,表明總RNA的提取效果較好,可以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖1 總RNA樣本電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis result of total RNA samp le

2.2 PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果

由圖2可以看出,530 bp GPX 1目的基因和411 bpβ-actin內(nèi)參2條擴(kuò)增片段條帶清晰整齊,可以進(jìn)行積分光密度分析。

圖2 PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果Fig.2 The electrophoresis test results of the PCR products

2.3 肝臟、腎臟、脾臟、肌肉組織中GPX1 mRNA的表達(dá)量比較

2.3.1 肝臟中GPX 1基因m RNA表達(dá)量比較

圖3顯示了不同硒源及添加水平對仔豬肝臟中GPX 1 mRNA表達(dá)的影響。由該圖可知,對不同硒源而言,當(dāng)以亞硒酸鈉為硒源時(shí),不同添加水平組之間GPX 1 m RNA表達(dá)量沒有顯著差異(P＞0.05);當(dāng)以酵母硒為硒源時(shí),0.3 mg/kg添加水平組的表達(dá)量顯著高于對照組(P＜0.05);當(dāng)以納米硒為硒源時(shí),0.5mg/kg添加水平組的表達(dá)量顯著高于對照組(P＜0.05)。對不同添加水平而言,0.1和0.3mg/kg 2個(gè)添加水平下各個(gè)硒源組間 GPX 1 m RNA表達(dá)量差異均不顯著(P＞0.05);在0.5mg/kg的添加水平下,納米硒組GPX 1m RNA表達(dá)量顯著高于亞硒酸鈉組和對照組(P＜0.05)。

圖3 不同硒源及添加水平對仔豬肝臟中GPX1 mRNA表達(dá)量的影響Fig.3 Ef fects of different selenium sources and leve ls on the expression level of GPX 1 m RNA in piglet liver

2.3.2 腎臟組織中GPX 1基因m RNA表達(dá)量比較

在腎臟組織中GPX 1基因mRNA表達(dá)量,由圖4可以看出,各試驗(yàn)組之間以及試驗(yàn)組與對照組之間GPX 1 m RNA表達(dá)量差異均不顯著(P＞0.05)。

2.3.3 脾臟組織中GPX 1基因m RNA表達(dá)量比較

脾臟組織中GPX 1基因m RNA表達(dá)量,由圖5可以看出,對不同硒源而言,不同添加水平的亞硒酸鈉組GPX 1 m RNA表達(dá)量之間沒有顯著差異(P＞0.05);酵母硒組0.3 m g/kg添加水平顯著高于各試驗(yàn)組和對照組(P＜0.05);納米硒組0.5 mg/kg添加水平組顯著高于各試驗(yàn)組和對照組(P＜0.05)。對于不同添加水平而言,3種硒源間在0.1 mg/kg添加水平下GPX 1 mRNA表達(dá)量差異均不顯著(P＞0.05);0.3m g/kg添加水平下,酵母硒組的GPX 1 m RNA表達(dá)量顯著高于亞硒酸鈉組(P＜0.05);0.5 m g/kg添加水平下,納米硒組的GPX 1 m RNA表達(dá)量顯著高于酵母硒組、亞硒酸鈉組和對照組(P＜0.05)。3種硒源間表達(dá)量差異均不顯著(P＞0.05);在0.5mg/kg添加水平下,納米硒組GPX 1m RNA表達(dá)量顯著低于亞硒酸鈉組(P＜0.05),也顯著低于對照組(P＜0.05)。

2.3.4 肌肉組織中GPX 1基因m RNA表達(dá)量比較

肌肉組織中GPX 1基因m RNA表達(dá)量,由圖6可以看出,在0.1～0.3 mg/kg添加范圍內(nèi),同一硒源的不同添加水平間差異均不顯著(P＞0.05)。對不同硒源而言,在0.1和0.3m g/kg 2個(gè)添加水平,

圖6 不同硒源及添加水平對仔豬肌肉中GPX1 mRNA表達(dá)量的影響Fig.6 Ef fects of different selenium sources and levels on the expression level of GPX 1 mRNA in pigletmuscle

3 討 論

Lei等[9]和Kevin等[10]等研究了以亞硒酸鈉為硒源,不同硒水平對大鼠肝臟GPX 1m RNA表達(dá)的影響,結(jié)果表明硒不影響GPX 1 m RNA的生成量,但影響m RNA的穩(wěn)定性,大鼠體內(nèi)硒缺乏時(shí),GPX 1 mRNA穩(wěn)定性降低,GPX 1 m RNA水平也隨之降低。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,以亞硒酸鈉為硒源時(shí),不同添加水平的亞硒酸鈉組之間GPX 1 m RNA表達(dá)量沒有差異,這與上述研究結(jié)果一致。胥保華[4]研究發(fā)現(xiàn),給雞飼喂0.5 mg/kg水平的硒時(shí),納米硒組肝臟 GPX 1 m RNA豐度比亞硒酸鈉組高31.25%(P＜0.05)。本試驗(yàn)結(jié)果表明,0.5 mg/kg納米硒組的肝臟組織中GPX 1 m RNA表達(dá)量顯著高于0.5 mg/kg亞硒酸鈉組(P＜0.05)。這與胥保華研究結(jié)果一致。

腎臟是動(dòng)物主要的排泄及分泌器官,也是機(jī)體中含硒量最高的器官,硒缺乏對腎臟影響極大。腎臟對硒代謝起重要作用,腎臟病變直接波及硒元素變化。各試驗(yàn)組腎臟組織GPX 1 m RNA表達(dá)量差異不顯著,說明不同硒源以及0～0.5 mg/kg的不同添加水平并不影響腎臟組織中GPX 1 m RNA表達(dá)量。Zhou等[5]以豬為試驗(yàn)對象對GPX 1、硒蛋白W 1(SepW 1)、GPX 2等基因表達(dá)的研究表明,在垂體和甲狀腺組織中這些基因的表達(dá)并不受硒不足或過量的影響,GPX 1 m RNA在腎臟中的表達(dá)可能具有和垂體、甲狀腺組織表達(dá)類似的規(guī)律;這也可能和GPX 1在腎臟硒代謝中的重要性有關(guān),GPX 1在腎臟組織中活性較高,硒能維持機(jī)體活化免疫應(yīng)答,提高腎小球?yàn)V過率,減輕炎癥發(fā)生。硒在腎臟組織中的重要性決定了其必有一套復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制,所以飼料中硒的劑量高低并不能對GPX 1 m RNA表達(dá)造成影響。關(guān)于不同硒源和水平對豬腎臟組織GPX 1 m RNA表達(dá)量的影響還需進(jìn)一步探討。

脾臟是機(jī)體的重要免疫器官,而硒能促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖及動(dòng)物免疫球蛋白的合成,提高免疫反應(yīng)[11]。GPX 1 m RNA在脾臟中的表達(dá)特征類似于肝臟。筆者在以往的研究中發(fā)現(xiàn)仔豬血清免疫指標(biāo)IgG、IgA、IgM、C3水平均以0.5 mg/kg納米硒組最高,均顯著高于對照組(P＜0.05),其中0.5 mg/kg納米硒組的IgG、IgM、C3水平顯著高于0.5mg/kg酵母硒組和亞硒酸鈉組(P＜0.05)[12]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),0.5 mg/kg納米硒組脾臟中GPX 1m RNA表達(dá)量顯著高于酵母硒組和亞硒酸鈉組(P＜0.05),這一結(jié)果表明飼糧中添加0.5 mg/kg納米硒可提高機(jī)體抗氧化能力,進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。

肌肉組織中,0.5 m g/kg納米硒組的GPX 1 m RNA表達(dá)量顯著低于0.5 mg/kg亞硒酸鈉組和對照組肝臟組織中GPX 1m RNA的表達(dá)量。Peter等[6]報(bào)道,在大鼠各組織中進(jìn)行硒蛋白m RNA表達(dá)量的研究,得出硒蛋白表達(dá)具有組織特異性。Evenson等[13]報(bào)道,在各種組織中GPX 1 m RNA表達(dá)明顯不同,肝和脾GPX 1m RNA表達(dá)都比肌肉高。這可能是肌肉組織GPX 1 m RNA表達(dá)量與肝臟組織GPX 1m RNA表達(dá)量相反的原因,關(guān)于這方面的研究還少有報(bào)道,有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

在飼糧中添加0.5 mg/kg的納米硒可以提高仔豬肝臟、脾臟中GPX 1m RNA的表達(dá)量。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:gzcheng1950@163.com

(編輯 尚彬如)

Effects of Sources and Levels of Dietary Selenium on the Expression Levelof mRNA of Celluar Glutathione Peroxidase Gene in Piglets

WANG Xiuna1GENG Zhongcheng1*WANG Yan2LIU Shengjun1WU Zhim in1

(1.College of Animal Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing163319,China;2.College of Animal Science and Technology,Nor theast Agricultural Un iversity,Harbin150030,China)

This experiment was conducted to study the effects of sources and levels of dietary selenium on the expression level of mRNA of celluar glutathione peroxidase gene in pig lets,and to provide a theoretical basis for the rational app lication of various selenium sources.NinetySanjiangWhite piglets of 35 days old with sim ilar body weight were selec ted in the experiment.They were random ly divided into 10 groups with 3 replicates per group and 3 piglets per rep licate.Piglets in the 9 experim ental groups were fed nano-selenium,yeast selenium and sodium selenite at0.1,0.3 and 0.5 mg/kg(by selenium content),respec tively.No extra selenium w as added to the diet of the controlgroup.Theexperimental period was 35 days.RTPCR was used to determ ine the expression level ofm RNA of GPX 1 gene in the liver,kidney,spleen,andm uscle tissues of the piglets.The results showed as follows:1)in the liver tissue,the expression level of GPX 1 mRNA in nano-selenium group was significantly higher than that in sodium se lenite group at0.5m g/kg addition level(P＜0.05),and the expression level in 0.5 mg/kg nano-selenium group and 0.3mg/kg yeast selenium group was significantly higher than that in the control group(P＜0.05);2)in the kidney tissue,the dif ferences of the expression level of GPX 1m RNA in allexperimental groups were not significant(P＞0.05);3)in the sp leen tissue,the expression level of GPX1 mRNA in the nano-selenium group at 0.5 mg/kg w as significantly higher than that in the sodium selenite group and the yeast selenium group(P＜0.05),and the expression level in 0.5 mg/kg nano-selenium group and 0.3 mg/kg yeastselenium group w as significantly higher than that in the con trol group(P＜0.05);4)in the muscle tissue,the GPX 1 m RNA expression level in the nano-selenium group at 0.5 mg/kg w as significantly low er than that in the sodium selenite group and the control group(P＜0.05).It is concluded that dietary addition of 0.5 mg/kg nano-selenium can increase the expression level of GPX 1 m RNA in the liver and sp leen tissues of piglets,but in themuscle tissue,the expression level w as lower than that in the sodium selenite group and the controlgroup.[Chinese Journal of Animal Nutrition,2010,22(6):1630-1635]

selenium;GPX 1;m RNA

S828

A

1006-267X(2010)06-1630-06

10.3969/j.issn.1006-267x.2010.06.024

2010-05-13

黑龍江省農(nóng)墾總局資助項(xiàng)目(HNKX IV-08-03-01);黑龍江省科技廳資助項(xiàng)目(PC 06S06)

王秀娜(1983—),女,黑龍江伊春人,碩士研究生,研究方向?yàn)閱挝竸?dòng)物營養(yǎng)。E-mail:xiuna320@163.com

*通訊作者:耿忠誠,教授,碩士生導(dǎo)師,E-mail:gzcheng1950@163.com