夏少秋 朱 穎 吳亞軍 宋 濤 趙 越 廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院 (廣東 510006)

六味地黃湯(Liuweidihuang Decoction,簡(jiǎn)稱(chēng) LW)由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓等六味傳統(tǒng)中藥組成。現(xiàn)代藥理研究表明,該方具有抗衰老、調(diào)節(jié)免疫和內(nèi)分泌的作用[1]。六味地黃生物制劑 (LiuweidihuangDecoction Metabolized by Photosynthetic bacteria,簡(jiǎn)稱(chēng) LW-PSB)是將優(yōu)選的光合細(xì)菌作為菌種,引入到六味地黃湯中進(jìn)行代謝,通過(guò)光合細(xì)菌的生物轉(zhuǎn)化功能和自身營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的利用,制備出的新型中藥生物制劑。研究表明,六味地黃生物制劑在增強(qiáng)免疫,治療腎陰虛證模型老鼠[2]等方面要優(yōu)于傳統(tǒng)的六味地黃湯。為了研究六味地黃生物制劑抗衰老作用及其抗衰老機(jī)制,本文首次以果蠅為研究對(duì)象,考察六味地黃生物制劑對(duì)果蠅壽命、抗氧化能力的影響,為該生物制劑的深入開(kāi)發(fā)和利用提供依據(jù)。

1材料與方法 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 美國(guó)野生型黑腹果蠅(Drosophila melanogaster),華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院提供。收集 8 h內(nèi)羽化未交配果蠅,雌雄分開(kāi),用基礎(chǔ)培養(yǎng)基在溫度為(25±1)℃,相對(duì)濕度為(60±5)%環(huán)境中培養(yǎng)。間隔 12h給予光照。

1.2 六味地黃湯(LW)的制備 熟地黃、山藥、山茱萸、澤瀉、牡丹皮、茯苓按處方的比例(8:4:4:3:3:3)配藥。加 8倍量的水,文火煎煮 1.5 h,濾過(guò)。藥渣再加 6倍量的水煎煮 1.5 h,濾過(guò)。合并濾液,濃縮至 0.5g/mL備用。

1.3 六味地黃湯生物制劑的制備(LW-PSB) 按上述方法制備的六味地黃湯經(jīng)自然發(fā)酵后,按一定比例加入光合細(xì)菌,于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),6個(gè)后即得。所制備的藥液含生藥材量同上,活菌數(shù)為 109個(gè) /mL。

1.4 實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基 培養(yǎng)基 I:為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,其主要成分:水 180mL,白糖 13g,瓊脂 1.3g,玉米粉 17g,酵母粉 1.4 g,丙酸 1 mL。以六味地黃生物制劑(上述制備)占培養(yǎng)基(0.3%,0.9%)的含量加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,依次配成培養(yǎng)基Ⅱ,Ⅲ。以 10mg/100g的量將維生素 C加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中配成培養(yǎng)基Ⅳ。

1.5 儀器與試劑 島津 UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司),AnKe TDL80-2B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),BOXUN SPX-250B-Z型恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠),GSH-PX,T-AOC,SOD,CAT檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所,計(jì)量單位分別為 U/mgprot,U/mgprot,U/mgprot,U/gprot。廣口三角瓶(50 mL),白砂糖、玉米粉由超市購(gòu)買(mǎi),其他試劑均為分析純。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法 1.6.1果蠅壽命實(shí)驗(yàn):收集 8h內(nèi)新羽化黑腹果蠅成蟲(chóng),乙醚麻醉分雌雄;在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中飼養(yǎng) 20d后,隨機(jī)分組試驗(yàn)。每組果蠅 400只,雌雄各半。每 4天更換新鮮培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后,每天定點(diǎn)觀察,記錄果蠅死亡數(shù),直到各組果蠅全部死亡為止。前半數(shù)果蠅生存時(shí)間的均數(shù)為半數(shù)死亡時(shí)間,全部果蠅壽命的算術(shù)平均數(shù)為平均壽命 ,最后 10只果蠅壽命的算術(shù)平均數(shù)為最高壽命,統(tǒng)計(jì)各組果蠅半數(shù)死亡時(shí)間,平均壽命,最高壽命。

1.6.2 GSH-PX、T-AOC、SOD、CAT的測(cè)定:收集 8h內(nèi)新羽化黑腹果蠅成蟲(chóng),乙醚麻醉分雌雄,隨機(jī)分組試驗(yàn)。每組果蠅 1000只 ,雌雄各半。每 4d更換新鮮培養(yǎng)基。在給藥后第 30d時(shí),制成 8%的組織勻漿;以 4000r/min離心 10min,取上清液待測(cè)。按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定每組上清液 GSH-PX、T-AOC、SOD、CAT活性。

2 結(jié) 果 2.1果蠅壽命試驗(yàn) 根據(jù)《中國(guó)保健食品的進(jìn)展》中延緩衰老功能的檢測(cè)方法來(lái)判定,果蠅生存實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)有最高壽命、平均壽命和半數(shù)死亡時(shí)間 3種。如果任一劑量組(或二組、三組 )的任一性別(或兩性)的最高壽命和(或)平均壽命顯著長(zhǎng)于對(duì)照組,即可判定實(shí)驗(yàn)樣品對(duì)果蠅有延緩衰老功能[3]。

表1 六味地黃生物制劑對(duì)雌性果蠅壽命的影響(±SD)

表1 六味地黃生物制劑對(duì)雌性果蠅壽命的影響(±SD)

注:各濃度組與空白對(duì)照組比較△P＜0.05,▲P＜0.01,◇P＜0.001;各濃度組與陽(yáng)性對(duì)照組比較◆P＜0.05。

組 別 數(shù)量 /只半數(shù)死亡時(shí)間/d最高壽命/d平均壽命/d空白對(duì)照組 174 40.17± 8.45 59.60±1.43 47.29±9.60 0.3PSB-LW組 197 40.78± 7.51 60.90± 1.20△ 47.67±9.08 0.9PSB-LW組 177 43.73± 6.03▲◆ 62.70± 0.67◇ 49.79± 7.99▲Vc組 196 41.65± 5.49 63.40± 1.90◇ 48.19± 8.17

由表 1表 2可知,與空白對(duì)照組比較,所有雌性實(shí)驗(yàn)組最高壽命均高于空白對(duì)照組,差異有顯著性(P＜0.05或 P＜0.001),在 0.9%組還延長(zhǎng)了果蠅的半數(shù)死亡時(shí)間和平均壽命,差異極為顯著(P＜0.01)。并且呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系。在雄性實(shí)驗(yàn)組中,與空白對(duì)照組相比,延長(zhǎng)了 0.3%濃度組的半數(shù)死亡時(shí)間、平均壽命以及最高壽命,差異有顯著性 (P＜0.01或 P＜0.001)。但 0.9%濃度組與空白對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異,說(shuō)明對(duì)六味地黃生物制劑的反應(yīng)存在著性別差異,這一現(xiàn)象可能與雌雄果蠅不同的生理代謝過(guò)程有關(guān),其原因機(jī)理需要進(jìn)一步研究?？偟膩?lái)說(shuō),通過(guò)對(duì)果蠅壽命的實(shí)驗(yàn)研究充分表明,六味地黃生物制劑延長(zhǎng)了果蠅的半數(shù)死亡時(shí)間、最高壽命和平均壽命,具有良好的抗衰老作用。

表2 六味地黃生物制劑對(duì)雄性果蠅壽命的影響(±SD)

表2 六味地黃生物制劑對(duì)雄性果蠅壽命的影響(±SD)

注:各濃度組與空白對(duì)照組比較△P＜0.05,▲P＜0.01,◇P＜0.001;各濃度組與陽(yáng)性對(duì)照組比較:◆P＜0.05。

組 別 數(shù)量 /只半數(shù)死亡時(shí)間/d最高壽命/d平均壽命/d空白對(duì)照組 194 43.49± 6.75 62.00±1.41 49.74±8.21 0.3 PSB-LW組 185 46.89± 7.64▲◆ 64.20± 1.23◇ 52.76± 8.17▲◆0.9PSB-LW組 193 43.86± 7.15 61.20±0.42 50.83±8.83 Vc組 188 42.84± 6.34 64.90± 1.45◇ 50.31±9.29

2.2 果蠅 T-AOC、GSH-PX、SOD、CAT的活性測(cè)定 由表 3顯示,跟空白對(duì)照組比較,各劑量組的雌雄果蠅的相關(guān)測(cè)試抗氧化酶均有顯著性差異(P＜0.05、P＜0.01或 P＜0.001)。各劑量組與 Vc組比較,雌雄果蠅的相關(guān)測(cè)試抗氧化酶也均有顯著性差異(P＜0.05),實(shí)驗(yàn)還明確顯示六味地黃生物制劑對(duì)各劑量組雌性果蠅的效果要優(yōu)與雄性果蠅,全部顯示出性別差異(P＜0.001)。綜上結(jié)果表明,六味地黃生物制劑顯著的提高了果蠅體內(nèi)抗氧化酶系的活性,增強(qiáng)了果蠅的抗氧化能力,延緩了果蠅的衰老。

表3 六味地黃生物制劑對(duì)果蠅 T-AOC、GSH-PX、SOD、CAT的影響(n=6,±SD)

表3 六味地黃生物制劑對(duì)果蠅 T-AOC、GSH-PX、SOD、CAT的影響(n=6,±SD)

注:各濃度組與空白對(duì)照組比較:△P＜0.05,▲P＜0.01,◇P＜0.001;各濃度組與陽(yáng)性對(duì)照組比較:◆P＜0.05。

組 別 性別 T-AOC/U/mgprot GSH-PX/U/mgprot SOD/U/mgprot CAT/U/gprot空白對(duì)照組 ♀ 2.21±0.09 7.29±1.58 38.15±0.58 119.85±27.31♂ 1.65± 0.05 23.97± 3.52 44.74± 0.95 194.30± 21.19 0.3 PSB-LW組 ♀ 2.85± 0.10◇ 87.71± 4.56◇◆ 63.27± 7.96◇◆ 446.19±58.80◇◆♂ 8.10± 0.33◇◆ 30.11± 7.17△ 85.46± 14.12◇◆ 459.57± 64.28◇◆0.9 PSB-LW組 ♀ 4.59± 0.36◇◆ 187.22±9.57◇◆ 74.16± 16.52◇◆ 594.33±82.12◇◆♂ 4.32± 0.05◇◆ 35.71± 3.93▲ 39.51± 3.47 281.46± 50.80△◆Vc組 ♀ 2.76± 0.08◇ 18.19± 2.07▲ 34.04± 0.95 122.43±34.78♂ 1.78±0.06 45.71± 4.00◇ 39.62±0.81 138.68±24.09

3 討 論 衰老是人類(lèi)面臨的重大難題之一,它是機(jī)體各種功能退化和紊亂的表現(xiàn)。本文采用果蠅為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,通過(guò)壽命實(shí)驗(yàn),酶實(shí)驗(yàn)來(lái)考察六味地黃生物制劑的抗衰老作用。果蠅是一種真核多細(xì)胞生物,具有高度純種,生存期短,繁殖能力強(qiáng),觀察指標(biāo)明顯等諸多優(yōu)點(diǎn),果蠅與人類(lèi)在身體發(fā)育、神經(jīng)退化、腫瘤形成等方面的機(jī)制,都有許多相通之處[4],因此果蠅是研究抗衰老藥物及其作用基礎(chǔ)的好材料。

壽命實(shí)驗(yàn)是通過(guò)觀察藥物對(duì)生物整體生存過(guò)程的影響,特別是對(duì)動(dòng)物半數(shù)死亡時(shí)間、平均壽命和最高壽命的影響,以確定其延緩衰老效應(yīng)的方法。壽命試驗(yàn)在延緩衰老的研究中是一個(gè)極為重要的研究項(xiàng)目。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,六味地黃生物制劑不同濃度都有延長(zhǎng)雌雄果蠅壽命的作用。對(duì)雄果蠅而言,0.3%濃度效果優(yōu)于 0.9%濃度;對(duì)于雌果蠅,0.9%濃度效果最顯著。顯示出性別差異,這可能與雌雄果蠅不同的生理代謝過(guò)程有關(guān)。這一結(jié)果與很多中藥的抗衰老實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。試驗(yàn)提示長(zhǎng)期使用抗衰益壽藥物可能以小量為宜,至于對(duì)其他動(dòng)物的延壽作用是否也存在濃度差異的現(xiàn)象還有待進(jìn)一步論證。

關(guān)于衰老有許多理論和假說(shuō),其中自由基理論是衰老理論中的一種重要學(xué)說(shuō)。該學(xué)說(shuō)隨著年齡的增長(zhǎng),體內(nèi)抗氧化酶活性降低,導(dǎo)致自由基反應(yīng)增強(qiáng)而誘發(fā)了過(guò)多的有毒性的過(guò)氧化物堆積而加速衰老[5],同時(shí)還發(fā)現(xiàn)與機(jī)體的抗疲勞密切相關(guān)[6]。體內(nèi)自由基清除系統(tǒng)如 SOD能清除 O2-,CAT能清除 H2O2,GSH-PX能還原過(guò)氧化物,從而維持自由基產(chǎn)生和清除的平衡[7]。因此,提高內(nèi)源性抗氧化酶的活性 (GSH-PX、T-AOC、SOD、CAT)清除體內(nèi)自由基是抗衰老的一種途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,六味地黃生物制劑主要表現(xiàn)出提高了果蠅體內(nèi) SOD,GSHPX,T-AOC,CAT的活性,但是不同酶的活性在雌雄果蠅間存在差異,這可能是物質(zhì)作用的各個(gè)抗氧化酶“靶”數(shù)量有性別差異,也可能是生物體存在選擇性 (如吸收的選擇性等)。

綜上所述,六味地黃生物制劑可通過(guò)提高內(nèi)源性抗氧化酶活性,清除自由基的途徑來(lái)增強(qiáng)果蠅抗氧化能力,延緩衰老過(guò)程,延長(zhǎng)果蠅壽命。

[1] 吳春芝,谷福根,劉紅在.六味地黃丸 (湯 )的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析,2005,5(3):189-192.

[2] 王德秀,胡旭光,臧建偉,等.六味地黃湯生物制劑對(duì)腎陰虛小鼠 HPA軸的調(diào)節(jié)作用研究 [J].陜西中醫(yī),2008,29(3):374-375.

[3] 王菊鳳,李鵠鳴.蛹蟲(chóng)草多糖對(duì)果蠅壽命影響的研究[J].中國(guó)野生植物資源,2008,27(3):39.

[4] Robert D C,Ivan B,David J C,et a1.Identification and characterization ofaDrosophilaortholog ofW RN exonuclease that is required to maintain genome integrity[J].Aging cell,2008,7(3):418-425.

[5] Harman D.Free radical theory of aging:origin of life,evolution and aging[J].Age,1980;3(4):100.

[6] 劉古鋒,吳偉康,段新芬,等.附子多糖對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)小鼠自由基代謝的影響[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2008,37(5):529-531.

[7] Wang X L.Practical M olecular Pharmacology(應(yīng)用分子藥理學(xué))[M].Beijing:Peking Union Medical,2005:351.