尹明錫 宋金鈴 時(shí)素華 宋 萌 耿 直 鄭光華 李志剛 北京中醫(yī)藥大學(xué)(北京 100029)

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)指因直接暴力或間接暴力作用在正常脊柱和脊髓組織,致?lián)p傷平面以下脊髓各項(xiàng)功能,包括運(yùn)動、感覺、括約肌和反射功能障礙 ,是人類致殘率最高的疾患之一,損傷修復(fù)也是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)一道尚未解決的難題。督脈電針治療 SCI有較好的臨床療效已得到醫(yī)學(xué)界廣泛的認(rèn)可,但其具體作用機(jī)制尚不完全清楚。督脈電針是電針中最常用的一種 ,治癱首取督脈[1-2]。本實(shí)驗(yàn)通過 RT-PCR研究SCI后 Slit2 mRN A的表達(dá) ,探討針刺治療 SCI作用機(jī)制 ,旨在為臨床針灸治療脊髓損傷后提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法 1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組 雄性健康 SD大鼠 72只,體重 240±20g,由北京維通利華動物中心提供。隨機(jī)分為空白組,模型組,電針組,藥物組。每組各 18只,每組再隨機(jī)分為三個(gè)時(shí)間組,6h、1d和 7d組。

1.2 針具 針灸針用華佗牌無菌針灸針,規(guī)格:0.30×13mm。電針用韓氏(HAN S)電針儀,型號 LH-202H。

1.3 脊髓損傷動物模型制作 用 10%水合氯醛(3.5mL/kg)腹腔麻醉,固定于自制的弓形手術(shù)臺上。按肋骨確定椎體序列,大鼠背部最下端肋骨緣橫對 T13為標(biāo)志,向上依次定位 T9-T11。背部脫毛劑脫毛;分離背部肌肉,沿深筋膜肌肉附著點(diǎn)剪開深筋膜,暴露棘突和椎旁肌肉;用刀片自棘突向兩側(cè)順次剝離椎旁軟組織,暴露 T9-T11段棘突和椎板;用組織鉗咬住 T10棘突輕輕上提,顯露 Tl0T11椎間隙,彎眼科剪剪除T10椎板及其上關(guān)節(jié)突和下關(guān)節(jié)突,暴露脊髓;參照經(jīng)典的改良式的 Allen’s打擊方法,用自制的打擊器打擊 T10段脊髓5cmx10g,立即移去打擊器,模型成功標(biāo)準(zhǔn)是:鼠尾持續(xù)劇烈擺動數(shù)秒,雙下肢及背部肌肉瞬時(shí)收縮,硬脊膜下出血,麻醉醒后雙下肢表現(xiàn)為不完全癱瘓。

1.4 治療 電針組于造模后大約半小時(shí)即大鼠蘇醒后先行 CBS評分,再選取“大椎”(DU14;第 7頸椎棘突下,向下斜刺 )、“命門”(DU4;第 2腰椎棘突下,向上斜刺)進(jìn)行針刺治療,進(jìn)針約 0.5-0.7cm。使用韓氏 LH-202H型穴位神經(jīng)刺激儀,大椎穴接陰極 ,命門穴接陽極,持續(xù)脈沖電流,頻率 2Hz,治療時(shí)間 20min,輸出強(qiáng)度在剛開始時(shí)以背部肌肉出現(xiàn)輕微抽動為度,待其適應(yīng)后則以雙下肢癱瘓肌肉出現(xiàn)有節(jié)律的收縮為度。電針組每天同一時(shí)間重復(fù)治療一次。

藥物組于造模后以 30mg/kg體重的甲基強(qiáng)的松龍尾靜脈注射。藥物組于第二天同一時(shí)間以 5.4 mg/kg體重的甲基強(qiáng)的松龍尾靜脈重復(fù)注射一次,之后再不給藥。

空白組和病理組不做任何治療,但要在同一時(shí)間均抓取一次,以保證應(yīng)激條件相同。

1.5 動物取材 造模后 6h、1d、7d取空白組、模型組、電針組及藥物組大鼠各 6只,動物處死后,迅速置于冰盤上取脊髓損傷區(qū) 1cm約 50mg的脊髓組織,置于勻漿器中,加入 Trizol試劑 lmL勻漿,冰上作用 l0min。

1.6 指標(biāo)的檢測 總 RN A抽提試劑盒 Trizol購自Invitrogen(GIBCO公司 ,USA),USA)。 Slit2、Nogo-A特異性引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成(采用 Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件)Slit2上、下游引物序列分別為 5CTTgCCCAT CAATgCCTTCTCCTA-3和5 gCAgCCgCACTTCACCACT T TCTC-3,擴(kuò)增產(chǎn)物長度 410bp;β-action為內(nèi)參照,上、下游引物5 rGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3和5 GATGCAGG GATGATGTTC-3,擴(kuò)增產(chǎn)物長度 356bp。參照 GIBCO公司RN A抽提試劑盒說明提取總 RN A,紫外分光光度計(jì)測定總RN A含量,-70℃保存。取總 RNA2uL,按照 PCR反應(yīng)試劑盒操作進(jìn)行 ,RT反應(yīng):采用 20μL反應(yīng)體系,Total RN A2 μL,Oligo(dt)primer 1 μL,H2O14.5ul,M Buffer 5.0 μL,dN TPS 1.0μL,RNase Inhibitor0.5 μL,M-MLV(反轉(zhuǎn)錄酶 )1.0μL,輕度離心 3～ 5s,反應(yīng)條件為 42℃60min,95℃5min,4℃保溫或 -20℃保存?zhèn)溆谩?PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 5min,然后 94℃、56℃、72℃分別 30 S,30循環(huán),最后 72℃延伸 8 min。 瓊脂糖凝膠電泳觀察 PCR產(chǎn)物,使用凝膠圖像分析軟件 Bandscan4.5測定實(shí)驗(yàn)組 Slit2條帶和內(nèi)參β-actin的灰度值,以兩者的比值表示 RT-PCR實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)物的相對含量,進(jìn)行定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)分析采用 SAS軟件進(jìn)行。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。組間比較采用方差分析。以P＜0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果 圖像中空白組、模型組、電針組、藥物組 6h、1d、7d的 RT-PCR檢測結(jié)果各得到一條 410bp(Slit2)的擴(kuò)增產(chǎn)物 (圖 1～ 3)。

2.1 根據(jù)結(jié)果分析統(tǒng)計(jì) 造模后 6h:①與空白組比較,模型組大鼠脊髓組織中 Slit2 mRNA基因表達(dá)升高,有顯著性差異(P＜0.05);②與模型組比較,藥物組和電針組的 Slit2 mRN A基因表達(dá)升高,有顯著性差異(P＜0.05)。③藥物組和電針組 Slit2mRNA基因表達(dá)互相比較,電針組略高于藥物組,無顯著性差異(P＞0.05)。

造模后 1d:①與空白組比較,模型組大鼠脊髓組織中 Slit2 mRN A基因表達(dá)升高,有顯著性差異(P＜0.05);②與模型組比較,藥物組和電針組的 Slit2 mRNA基因表達(dá)升高,有顯著性差異(P＜0.05)。③藥物組和電針組 Slit2 mRN A基因表達(dá)互相比較,電針組略高于藥物組,無顯著性差異 (P＞0.05)。

造模后 7d:①與空白組比較,模型組大鼠脊髓組織中 Slit2 mRN A基因表達(dá)升高,有顯著性差異(P＜0.05);②與模型組比較,藥物組和電針組的 Slit2 mRNA基因表達(dá)升高,有顯著性差異(P＜0.05)。③藥物組和電針組 Slit2mRN A基因表達(dá)互相比較,電針組略高于藥物組,無顯著性差異 (P＞0.05)。

表1 脊髓組織中 Slit-2基因表達(dá)圖像分析結(jié)果(±SD)

表1 脊髓組織中 Slit-2基因表達(dá)圖像分析結(jié)果(±SD)

注:與模型組比較△ P＜0.05。

組 別 n 6h n 1d n 7d模型 組 6 0.410± 0.049 6 0.503± 0.031 6 0.617± 0.10空白 組 6 0.288±0.063△ 6 0.225±0.061 6 0.217±0.022△電針組 6 0.616±0.031△ 6 0.714± 0.102△ 6 0.813±0.114△藥物組 6 0.580±0.134△ 6 0.694± 0.112△ 6 0.745±0.059△

2.2 脊髓 Slit-2基因表達(dá)圖

圖中最左邊泳道為 maker,2～ 7泳道為 1d模型組,8～ 13泳道為 1d空白組,14～ 19泳道為 1d藥物組,20～ 25泳道為 1d電針組。從圖中可以看出,模型組條帶顏色較暗,表示其表達(dá)較少;電針組和藥物組條帶顏色較亮,表示其表達(dá)較多。

3 討 論 SCI屬中醫(yī)“截癱”、“痿癖”范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脊髓損傷雖在脊柱,主要損及督脈。督脈總督周身之陽經(jīng),有統(tǒng)攝元陽、振奮全身陽經(jīng)的功能,且督脈與任、沖、陽維脈皆有聯(lián)系,可調(diào)節(jié)全身氣血,在全身經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)中處于主導(dǎo)地位,與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所描述的脊髓作為中樞神經(jīng)的功能相類似。因此一旦損傷,則氣血瘀滯,累及手足三陽經(jīng),導(dǎo)致經(jīng)氣不利、經(jīng)絡(luò)不通 ,或者出現(xiàn)肢體麻木 ,不能活動,甚至因陽經(jīng)久病而損及陰經(jīng),最終出現(xiàn)陰陽俱虛?？傊?中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脊髓損傷后所產(chǎn)生的各種癥狀,乃因瘀阻督脈,樞機(jī)統(tǒng)帥失職 ,三陽經(jīng)氣血逆亂而致。其病因?yàn)椤梆鲅?病機(jī)為“督脈樞機(jī)不利”。因此在治療上應(yīng)該疏通督脈以壯一身之陽氣,而氣能行血,氣壯則血活,血活則瘀去,瘀去則氣機(jī)調(diào)暢、絡(luò)活經(jīng)通。督脈電針調(diào)節(jié)督脈經(jīng)氣、疏通氣血,還是一種脈沖電場,具有針刺和電場雙重作用。大量臨床實(shí)踐及實(shí)驗(yàn)證明[3-5],電針能促進(jìn) SCI后神經(jīng)功能的恢復(fù)。

Slit是近年來發(fā)現(xiàn)的重要神經(jīng)生長導(dǎo)向因子[6]。分子質(zhì)量170～ 190KD,它以濃度梯度指導(dǎo)生長錐靶向生長[7],通過排斥性軸突導(dǎo)向,促進(jìn)軸突分支,并且在神經(jīng)發(fā)育過程中通過排斥作用引導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞遷移[8,9]。Slits的主要功能為:對軸突生長的排斥性導(dǎo)向作用;引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞運(yùn)動的導(dǎo)向作用;促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)軸突的延伸和分枝;抑制化學(xué)趨向因子誘導(dǎo)的白細(xì)胞運(yùn)動[10]。

哺乳動物中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn) 3種亞型:Slit1,Slit2,Slit3[11,12],其中在指導(dǎo)脊髓抻經(jīng)投射方面。Slit2起主導(dǎo)作用[13]。 Tessier-Lavigne實(shí)驗(yàn)室證明 Slit2可排斥某些運(yùn)動神經(jīng)元的軸突,還可促進(jìn)感覺神經(jīng)元軸突的延伸。通過原位雜交觀察到 Slit2 mRN A表達(dá)在發(fā)育期脊髓神經(jīng)管的腹側(cè)、背側(cè)中線結(jié)構(gòu)以及運(yùn)動神經(jīng)元前體區(qū)域。Slit2作為關(guān)鍵蛋白指導(dǎo)神經(jīng)纖維的生長方向發(fā)揮重要作用[14]。

我們在實(shí)驗(yàn)中觀察到,在正常成年大鼠(空白組)脊髓前角運(yùn)動細(xì)胞中,slit2 mRN A表達(dá)較低 ,脊髓損傷后的 6h、1d和 7d slit2mRN A表達(dá)顯著升高,炎性細(xì)胞開始在損傷周圍浸潤.此時(shí)損傷位點(diǎn)上方前角運(yùn)動神經(jīng)元中 slit2 mRN A的表達(dá)明顯增加,而電針組和藥物組 6h、1d和 7d slit2 mRN A表達(dá)明顯升高程度大于模型組。這提示,電針治療對大鼠脊髓損傷后 Slit-2 mRN A表達(dá)具有明顯的促進(jìn)作用,可能對軸突的正確導(dǎo)向性生長發(fā)揮重要作用。

諸多神經(jīng)營養(yǎng)因子如 NGF,N T-3,bFGF,BDN F,GDNF等在 SCI后均有表達(dá),但再生軸突都很短且往往不能和損傷遠(yuǎn)端建立正確的聯(lián)系,而 Slit作為一種大分子蛋白質(zhì),其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性本身就已說明它在引導(dǎo)神經(jīng)生長方面的重要地位,本實(shí)驗(yàn)觀察到督脈電針能促進(jìn)大鼠脊髓損傷后 Slit2大量表達(dá)。督脈電針可能是通過提高 SCI后脊髓 Slit的表達(dá),引導(dǎo)再生的軸突穿越脊髓損傷區(qū)并沿著正確的路徑投射到靶目標(biāo),實(shí)現(xiàn)和下位靶器官的精確聯(lián)系,從而促進(jìn) SCI后的修復(fù)。

SCI后的再生修復(fù)是一個(gè)非常復(fù)雜的過程,脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)與臨床研究已取得了新的進(jìn)展,治療效果不斷提高。但電針刺激通過什么樣的信息傳導(dǎo)通路對 Slit2表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,以及電針治療 SCI,均有待于學(xué)者們進(jìn)一步深入探索。

[1] 陳志華.150例外傷性截癱的針刺治療與體會 [J].天津中醫(yī),1989,(5):5.

[2] 許健鵬,王明久,劉學(xué)茹,等.以督脈電針為主治療脊髓損傷 80例的臨床觀察[J].針灸臨床雜志,1994,10(6):13-15.

[3] 徐 斌.脊髓針為主綜合方法治療外傷性截癱 286例療效觀察 [J].中國針灸 ,1990,10(2):7.

[4] 李志剛,劉書坤.近十年電針治療脊髓損傷的臨床和實(shí)驗(yàn)研究概況[J].中國中醫(yī)藥科技,2004,11(6):386-388.

[5] 韓清民,謝 杰,柴生顫,等.電針督脈對實(shí)驗(yàn)性脊髓損傷大鼠水通道蛋白-4的影響 [J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2005,7(25):637-639.

[6] Brose K,Bland K,Wang KH,et a1.Slit proteins bind robo receptors and have an evolutionarily conserved role in repulsive axon guidance[J].Cell,1999,96:795-806.

[7] Wang KH,Brose K,Arnott D,et a1.Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching[J].Cell,1999:771-784.

[8] Wu W,Wong K.Chen J,et a1.Nature,1999;400(6742):331-336.

[9] De Castro F.News Physiol Sci,2003;18:130-136.

[10] 王 楓,都愛蓮.Slit:一種新的神經(jīng)生長導(dǎo)向因子.國外醫(yī)學(xué)神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)分冊,2002,29(5):454-455.

[11] Neil V,Victor L,Izabell M,et a1.Expression patterns of slit and robo family members during vertebrate limb development[J].Mechanisms of Development,2001,106:175-180.

[12] Li Jia,Lan Cheng,Jonathan R,et a1.Slit/Robo signaling is necessary to confine early neural crest cells to the ventral migratory pathway in the trunk[J].Devlopmental Biology,2005,282:411-421.

[13] Plump AS,Emkine L,Sabatier C,et al.Slitl and Slit2 cooperate to prevent premature midline crossing of retinal axons in the mouse visual system[J].Neuron 2002 Jan 17,33(2):219-232.

[14] 劉 肅,劉 華.導(dǎo)向因子 S1it2在大鼠脊髓損傷后的表達(dá)及其意義[J].中國矯形外科雜志,2007,15(4):293-295.