王振宇

中樞神經(jīng)損傷后軸突變性的研究進展

王振宇

軸突變性是神經(jīng)損傷后病理變化的主要特征之一，但軸突變性不僅存在于神經(jīng)系統(tǒng)外傷中，還廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病和慢性炎癥疾病的過程中[1-3]。既往對神經(jīng)損傷后的研究主要集中于神經(jīng)元的病理改變，損傷后神經(jīng)可塑性和神經(jīng)再生也主要從神經(jīng)元的角度進行研究，通過給予神經(jīng)營養(yǎng)因子、去除膠質瘢痕、運用組織工程支架、移植相關細胞等手段促進胞體的生長[4-6]，而對軸突變性的研究較少，并且近幾年研究發(fā)現(xiàn)，軸突變性和胞體死亡可能擁有獨立的機制。本文就中樞神經(jīng)損傷后軸突變性的研究進展進行綜述。

一、軸突變性組織學層面的變化及分類

軸突變性可以有軸突連續(xù)性的中斷，也可以無連續(xù)性的變化。軸突變性的方向包括向胞體遠端的順行性變性和向胞體近端的逆行性變性。根據(jù)軸突開始變性的時間節(jié)點又可以分為急性變性和慢性變性。

1.急性軸突變性：急性軸突變性是指中樞神經(jīng)損傷后幾個小時內(nèi)發(fā)生的快速軸突崩解，它主要發(fā)生在軸突損傷處近 、遠 側 300～400 μm 的 范 圍 內(nèi)[7]。 Kerschensteiner 等[7]和Knoferle 等[8]分別描述了 脊 髓 和 視 神 經(jīng)中的急性軸突變 性 。該類型變性速度在不同模型和不同器官是不同的，比如小鼠脊髓中軸突的急性變性速度比視神經(jīng)中的快。但基本的病理變化是類似的：(1)在損傷后起始的 10～30min 內(nèi)，軸突的宏觀形態(tài)是沒有改變的；(2)30m in后軸突的超微結構出現(xiàn)了可以觀察到的變化，這主要包括神經(jīng)細絲的聚合和錯位，以及后續(xù)微管的破碎[9]；(3)此外，線粒體和囊泡等細胞器在局部聚集，提示軸漿運輸可能受到了損害；(4)急性變性的另一個超微結構的特 征是自 噬過程的激活[10]；損傷 后 6 h 后 可以發(fā)現(xiàn)軸突內(nèi)自噬體數(shù)量的明顯增加；(5)外周神經(jīng)在損傷 24 h后即可有神經(jīng)出芽的發(fā)生，但該再生缺乏適當?shù)姆较蛐訹7]。

2.沃勒變性：沃勒變性通常是指遠離損傷部位的軸突變性。這些部位沒有受到急性軸突變性的影響，損傷24～72 h后仍保持了形態(tài)的穩(wěn)定，但接下來仍會產(chǎn)生類似急性變性的變化。沃勒變性的速度和方向是差異較大的。在體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)元細胞中，沃勒變性的速度大約為 0.4mm/h[11]；在小鼠坐骨神經(jīng)中速度大約為 24mm/h[12]。在外周神經(jīng)橫斷性損傷中，沃勒變性是順行性發(fā)生的，而在外周神經(jīng)擠壓性損傷中，沃勒變性卻是逆向發(fā)生的，由損傷部位的遠側端向損傷部分發(fā)生。

3.慢性軸突變性：慢性軸突變性更為復雜，有多種形態(tài)改變，包括“逆行性變性”和軸突肥大。“逆行性變性”可能由突觸連接障礙和/或軸突遠端變性啟動，由損傷的遠側端向近側端發(fā)生類似沃勒變性的改變[13-14]。軸突肥大時可見聚集的異形線粒體和其他細胞器，并且伴隨著軸漿運輸?shù)膿p害，軸突肥大后期也會導致類似沃勒變性的軸突瓦解[15]。

二、軸突變性的細胞學層面的變化

軸突變性時，細胞學層面也發(fā)生了復雜的變化，但軸突變性的基本病理過程均可歸納為軸突膜通透性增強、線粒體功能障礙及軸漿運輸障礙3類。

1.軸突膜通透性增強：軸突膜是維持軸突完整性以及正常功能的重要保證，各種損傷后可以改變軸突膜的通透性，引起軸突內(nèi)鈣離子和鈉離子病理性的增高。鈣離子可以通過破損的軸突膜、激活的鈣離子介導的鈣內(nèi)流和軸突內(nèi)鈣庫的釋放等方式進入軸突膜內(nèi)[16]。異常的鈣庫操縱性鈣內(nèi)流(SOCE)可能參與彌散性軸索損傷早期神經(jīng)元的鈣超載，這個過程是通過增強一種重要的內(nèi)質網(wǎng)鈣離子感受器STIM 1的表達來實現(xiàn)的[17]。

鈣離子的增加后續(xù)又激活了鈣依賴性的蛋白酶的活化，比如鈣蛋白酶(Calpain)。Calpain 是中樞神經(jīng)內(nèi)廣泛分布的Ca2+依賴的半胱氨酸蛋白酶，細胞內(nèi)增高的 Ca2+可以增加Calpain 的活性，并且引起其下游細胞骨架及膜蛋白降解[18]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，Calpain 的底物很多，因此 Calpain 參與了細胞的多種功能的完成。Calpain 在沃勒變性中介導了軸突和突觸的退變[19]。

2.線粒體功能障礙：線粒體供給軸突以能量，維持軸突的正常功能。軸突損傷后線粒體的功能改變、運輸障礙和凋亡反應的激活均會影響軸突的功能障礙[20]。研究人員還發(fā)現(xiàn)在彌散性軸索損傷的動物模型中，鈣離子的內(nèi)流和 calpain的激活并不是在軸突的所有部位均出現(xiàn)，而是和線粒體的聚集部位明顯相關[21]，這種局部的線粒體聚集也許是由于細胞骨架的破壞和其他細胞器的阻擋。

3.軸漿運輸障礙：由于軸突末端距離神經(jīng)胞體非常遠，所以軸漿運輸在維持軸突的正常結構和功能中十分重要。軸漿運輸主要由2類蛋白介導，驅動蛋白推動軸漿的快速順向運輸，動力蛋白推動軸漿的快速逆向運輸[22]。已有證據(jù)表明，小鼠在驅動蛋白超家族成員KIF1Bβ上的突變會導致對突觸囊泡的運輸障礙，進而導致漸進性的肌力下降等神經(jīng)病的發(fā)生[23]；動力蛋白重鏈的突變會導致雜合小鼠的運動神經(jīng)元和軸突變性[24]。

三、軸突變性的特異機制

既往認為軸突變性和年齡及神經(jīng)元胞體有直接關系，但后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)逐個否定了先前的看法。軸突的再生和年齡是由不同的機制控制的：daf-2/insulin 受體和 daf-18/PTEN-mTOR 通路皆調(diào)控動物的生命長度，daf-2/insulin 受體通過daf-16/FOXO-DLK 通路調(diào)控年齡依賴性的神經(jīng)軸突再生，但 daf-18/PTEN-mTOR 通路卻可以在成年和老年動物身上都實現(xiàn)神經(jīng)再生的調(diào)控[25]。

而Wlds突變小鼠的發(fā)現(xiàn)更是不僅否定了軸突變性依賴神經(jīng)元的觀點，而且為研究軸突變性的特異機制打開了一扇窗。Lumn 等[26]在 1989 年發(fā)現(xiàn)，Wlds突變小鼠周圍神經(jīng)切斷1～2周后損傷遠側段軸突并不發(fā)生變性，而正常野生型小鼠典 型 的 沃 勒變性常發(fā)生于軸突切斷后 2～3 d。 將 Wlds突變小鼠的神經(jīng)纖維移植到野生型小鼠體內(nèi)，其軸突的變性速度和在 Wlds突變小鼠體內(nèi)的速度一致。此外，Wright等[27]還發(fā)現(xiàn) Wlds小鼠的軸突保護作用和其基 因劑量 呈現(xiàn)正 相關。Wlds編碼的融合蛋白由 N 端 70 個氨基酸的泛素因子 E4B (UBE4B)的片段、C 段尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)合成酶尼克酰胺轉移酶 1(Nmnat1)及中間 的 18 個氨基酸共同組成[28]。Wlds突變基因可以明顯減慢軸突的變性速度。正常的野生型小鼠體內(nèi)軸突切斷后數(shù)小時即刻開始發(fā)生沃勒變性，而 Wlds突變小鼠切斷軸突遠端的軸索可以在同樣的損傷后的數(shù)月內(nèi)維持結構完整，甚至晚于所連接的胞體開始變性的時間。Wlds編碼的融合蛋白對軸突的保護作用在各個物種間廣泛存在，在果蠅和嚙齒類動物中均顯示了類似的作用。Wlds編碼的融合蛋白在果蠅中為 dNmnat，在哺乳類動物中為Nmnat2。

Fang 等[29]發(fā)明了一種新型的易觀察的軸突損傷模型，他們通過果蠅的 Gal4-UAS 系統(tǒng)表達綠色熒光蛋白，而該熒光蛋白受 dprpGaw-Gal4 驅動子的調(diào)控，并可以由果蠅翅上的感覺神經(jīng)元表達出現(xiàn)。觀察軸突變性時，研究人員就僅僅觀察果蠅翅上的熒光蛋白表達就可以了。Avery 等[30]發(fā)現(xiàn)核外的dNmnat蛋白主要存在于線粒體上，即使在軸突沒有損傷的情況下，dNmnat高表達的軸突中線粒體的數(shù)量和體積雖然和低表達軸突中的類似，但是活躍的線粒體明顯更多。Fang 等[29]發(fā)現(xiàn)和 dNmnat低表達的軸突相比，dNmnat高表達的軸突中線粒體明顯增多，提示軸突的長期生存可能和內(nèi)部線粒體的存在數(shù)量有關。進一步研究，干擾線粒體順行軸漿運輸需要 的 連接蛋白 M ilton，軸突中線 粒體明顯減 少，并且該現(xiàn)象不能被再次高表達的dNmnat所改變。但作者沒有進一步區(qū)分，干擾 M ilton 后軸漿運輸中的其他細胞器和物質是否也受到了干擾。這表明軸突變性的關鍵環(huán)節(jié)應該在線粒體 上 。 后 續(xù) Kitay 等[31]又 發(fā) 現(xiàn) 在 果 蠅 的 運 動 神 經(jīng) 中 ，干 擾M ilton 后并不引起軸突的快速變形。所以感覺、運動神經(jīng)的變性機制也許還存在著差異。Wishart等[32]發(fā)現(xiàn) Wlds表達引起的下游各種變化集中于細胞周期的改變，軸突的易損傷性和有絲分裂后及終末分化的神經(jīng)元修飾的細胞周期通路有密切關系。另外，Wlds的表達誘導了細胞周期相關基因的增加，比如，NAD 依賴基因和 Pttg1-依賴基因，但 Wlds沒有改變細胞的增殖速度。

但 Wlds也許并不是軸突變性的唯一機制。比如，Wlds并不削弱 SOD1-介導的運動神經(jīng)元病[33]，并且觀察到突觸前末梢內(nèi)線粒體和突觸囊泡的聚集，也許逆行軸漿運輸?shù)恼系K是SOD1-介導的神經(jīng)損傷的一個原因。此外，還有其他學者從另外的角度對軸突變性的機制進行了研究。Zhu 等[34]研究了 Wlds突變小鼠，該小鼠在中樞和外周神經(jīng)有明顯的神經(jīng)變性，并存在漸進性的共濟失調(diào)表現(xiàn)。Zhu 等[34]發(fā)現(xiàn) Wlds突變小鼠的軸突變性是由 Wlds和 Bax蛋白突變調(diào)控的，Atp8a2是責任基因。Atp8a2廣泛存在于腦部、脊髓以及視網(wǎng)膜中，擁有磷脂酰絲氨酸移位酶活性。突變的Atp8a2 喪失了這種活性，導致了軸突變性。

四、軸突變性的無創(chuàng)性觀察

軸突變性歷史上是通過病理切片和染色診斷的，包括常規(guī)的 HE 染色，還有特殊的銀染色、Palmgren 染色技術等[35]?，F(xiàn)在更多的病理診斷是通過免疫組織化學的方法來診斷了。免疫組織化學的方法中通常選取軸漿運輸中蛋白的抗體來實現(xiàn)，最常用的淀粉樣前蛋白[36]。淀粉樣前蛋白通過軸漿順行運輸在軸突中移動，任何對軸突的干擾和破壞，會導致該蛋白動力學的異常及局部的腫脹，這可以通過免疫組織化學的方法明顯的顯示出來。免疫組織化學技術已經(jīng)成為診斷軸突變性的金標準。

但病理診斷是侵入性檢查，僅僅在實驗或者尸檢中應用，臨床價值有限。所以這種現(xiàn)實促使了對軸突損傷非侵襲性 檢 查 的 研 究 。 彌 散 性 張 力 成 像(diffusion tensor imaging，DTI)是較為有前景的一項技術[37]。在輕度軸索損傷的患者中，DTI也可以發(fā)現(xiàn)白質的異常，包括各向異性分數(shù)及其他DTI相關的指標的變化。Qin 等[38]通過平均擴散系數(shù)、各向異性分數(shù)、橫向特征值等建立擴散指數(shù)，認為可以和病理改變 相 關 起 來 。 此 外 ，Greer 等[39]在 輕 微 彌 散 性 軸 索 損 傷(diffuseaxonal injury，DAI)小鼠的離斷和未離斷軸突的神經(jīng)胞體上均檢測到了電生理的異常。腦干微波的逐步消失或者延遲以及聽覺誘發(fā)電位的中度延遲被認為是鑒別軸突亞臨床損傷的方法。還有一些學者在軸突損傷相關的血液學指標的研究方面進行了嘗試，并且取得了一些線索。一些研究發(fā)現(xiàn)aII血影蛋白降解產(chǎn)物SBDP150和145與急性神經(jīng)元凋亡有關，SBDP120 與細胞的死亡瀑布反應有關[40]。

五、軸突變性的復雜性

除了上述歸納的較為重要的機制以外，很多病理變化參與了軸突變性的發(fā)生和發(fā)展。例如，磷酸酶和張力蛋白同源基因(PTEN 基因)是一抑癌基因，敲除 PTEN 后可以促進軸突的生長，通過短發(fā)夾樣RNA外源性抑制PTEN也可以促進軸突生長；氧壓力和前炎性細胞因子可以導致神經(jīng)軸突的變性；維生素E缺乏可以導致小鼠海馬神經(jīng)元的軸突變性。

并且，即使僅僅考慮上述重要的機制，它們之間也是互相聯(lián)系的。有研究發(fā)現(xiàn)野生型動物軸突損傷后存在 Ca2+峰，但 dNmnat高表達的軸突內(nèi) Ca2+峰明顯減小，并且 dNmnat高表達軸突內(nèi)的線粒體結合 Ca2+的能力也比野生型的高，可以減弱 Ca2+峰的產(chǎn)生。

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2014-11-27)

(本文編輯：張麗)

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.01.014

100191 北京，北京大學第三醫(yī)院神經(jīng)外科

王振宇，Email：wangzhenyu@163.com

王振宇 .中樞神經(jīng)損傷后軸突變性的研究進展[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2015,1(1):49-52.