王麗軍 王會(huì)麗 張 茹 劉麗萍 河北省唐山市中醫(yī)醫(yī)院 (唐山 063000)

柏硝祛毒洗劑是由黃柏、芒硝、地榆、防風(fēng)、甘草等組成的復(fù)方制劑。具有消腫止痛,涼血止血,清熱利濕,臨床用于伴有血便、疼痛、紅腫、瘙癢等癥狀。本實(shí)驗(yàn)對(duì)柏硝祛毒洗劑的急性毒性安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材 料 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 潔凈級(jí) wister大鼠,雌雄各半(雌性性無孕),體重在 170～ 210g,3～ 4月齡。由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):SCXK(豫)2005-0001。飼料為本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心自制干糕。大鼠 5只 /籠,自由飲水和攝食。白色豚鼠,雌雄兼有,體重 250-290g,由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):SCXK(豫)2005-0001。健康白色家兔,雌雄兼有,體重2.00± 0.2kg。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室 溫度為 19± 3℃。濕度 60±5%,采光12h/d,排風(fēng)扇通風(fēng),每天 4次 ,每次至少 30min,環(huán)境安靜無噪音。

1.3 試 劑 硫化鈉(天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠,批號(hào):200061138),2,4二硝基氯代苯 (上海試劑一廠提供,批號(hào):99-07-01,用 70%乙醇將其配成 1%的致敏濃度和 0.1%激發(fā)濃度)。

2 方法與結(jié)果 2.1 急性毒性試驗(yàn) 2.1.1方法:選擇健康 wister大鼠 64只,適應(yīng)環(huán)境 5d后,于實(shí)驗(yàn)前 24h用 8%硫化鈉脫掉大鼠背部脊柱兩側(cè)毛約 8cm×4cm,其中 32只大鼠保持皮膚完整不受損,隨機(jī)分成 4組 ,每組 8只,即對(duì)照組(蒸餾水),柏硝祛毒洗劑高劑量組(將柏硝祛毒洗劑用原溶液,按40mL/kg均勻涂抹于脫毛處,每次 10mL/kg,每小時(shí)涂一次,共 4次給完)。柏硝祛毒洗劑中劑量組 (將柏硝祛毒洗劑用開水配制成 1∶3溶液,按 40mL/kg均勻涂抹于脫毛處,每次10mL/kg,每小時(shí)涂 1次,共 4次給完)。柏硝祛毒洗劑低劑量組 (將柏硝祛毒洗劑用開水配制成 1∶ 6溶液,按 40mL/kg均勻涂抹于脫毛處,每次 10mL/kg,每小時(shí)涂一次,共 4次給完)。另 32只大鼠實(shí)驗(yàn)時(shí)用 16號(hào)針頭,在脫毛且消毒的皮膚上劃“#”字,以皮膚滲血為度,其分組與給藥劑量同完整皮膚急性毒性試驗(yàn)。涂抹藥物后每日觀察并記錄大鼠的體重,精神狀態(tài),四肢活動(dòng),皮膚,毛發(fā),眼睛,黏膜,呼吸的變化,有無發(fā)抖,震顫,流涎,腹瀉,嗜睡,昏迷等全身中毒表現(xiàn)和死亡情況。

2.1.2 結(jié)果:涂抹柏硝祛毒洗劑后,大鼠未見異常反應(yīng),飲食,體重,大小便和活動(dòng)均正常;完整皮膚急性毒性試驗(yàn)組大鼠皮膚無紅斑,無水腫,無死亡;破損皮膚急性毒性試驗(yàn)組大鼠皮膚劃痕處可見紅腫,結(jié)痂,劃痕周圍皮膚無紅腫,無死亡,與對(duì)照組比較無差別。

2.2 皮膚刺激性試驗(yàn)

2.2.1 方法:選擇健康白色家兔 16只,雌雄兼有,體重 2.00±0.20kg,適應(yīng)環(huán)境 5d,與給藥前 24h在兔背部脊柱兩側(cè)用8%硫化鈉脫毛 (兩側(cè)約 50cm2,無紅斑、水腫及破損)。 16只家兔隨機(jī)分成 4組,每組 4只 ,設(shè)單次涂抹完整皮膚組、單次涂抹破損皮膚組、多次涂抹完整皮膚組和多次涂抹破損皮膚組。均涂抹給藥(破損皮膚組,每只家兔背部脊柱兩側(cè)去毛區(qū)在涂藥前用針頭在涂藥部位皮膚劃“#”字以滲血為度),左側(cè)為受試區(qū),右側(cè)為對(duì)照區(qū)。分別于給藥區(qū)涂抹柏硝祛毒洗劑溶液(原液)0.2mL/cm2;對(duì)照區(qū)涂以等量的蒸餾水 ,用一層玻璃紙覆蓋保濕,再加紗布覆蓋保護(hù),再用膠布適當(dāng)固定。單次涂抹組:涂抹后 24h,用溫水洗去殘留的受試藥;多次涂抹組:2次 /d,連續(xù)7d,末次涂抹后 24h,用溫水洗去殘留的受試藥。去除受試藥后1h、24h、48h、72h觀察涂抹部位有無紅腫和水腫等情況,以及上述變化的恢復(fù)情況和時(shí)間。

2.2.2 結(jié)果判定及評(píng)價(jià):每只動(dòng)物皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分按下表進(jìn)行刺激反應(yīng)評(píng)分,計(jì)算出平均分值。皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)按無刺激性(＜0.5),輕度刺激性 (＜2.0),中度刺激性(＜6.0),強(qiáng)刺激性(＞6.0)進(jìn)行刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)。

表1 皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表2 皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2.2.3 結(jié)果:一次給藥或多次給藥結(jié)束后,對(duì)照區(qū)與受試區(qū)比較觀察,皮膚刺激反應(yīng)強(qiáng)度均 ＜0.5分,多次給藥期間也未觀察到皮膚有紅斑、水腫等刺激反應(yīng),涂藥部位無色素沉著,無出血點(diǎn),無皮膚粗糙及皮膚菲薄等現(xiàn)象。結(jié)果表明:柏硝祛毒洗劑一次給藥或多次給藥對(duì)兔完整皮膚和破損皮膚均無刺激性。

2.3 皮膚過敏試驗(yàn) 2.3.1方法:取健康白色豚鼠,與試驗(yàn)前 24h,采用 8%硫化鈉脫毛劑,將全部受試豚鼠背部脊柱兩側(cè)去毛(每側(cè)約 4cm×4 cm,無紅斑、水腫及破損)。24只豚鼠按體重隨機(jī)分成 3組 ,每組 8只,分別是受試藥組(柏硝祛毒洗劑)、空白對(duì)照組(蒸餾水)、陽性對(duì)照組(2,4二硝基氯代苯)。將柏硝祛毒洗劑(原液)0.5mL涂在左側(cè)脫毛區(qū),6h后用溫水擦去殘留受試藥,第 7d和 14d以同樣方法重復(fù)?？瞻讓?duì)照組涂蒸餾水 0.5mL,陽性對(duì)照組涂以 1%的 2,4二硝基氯代苯 0.5mL。于末次涂藥 14d時(shí)在動(dòng)物右側(cè)脫毛區(qū)涂藥 0.5mL,6h后去除受試物,立即觀察,并于 24h,48h和 72h重復(fù)觀察豚鼠脫毛區(qū)皮膚涂抹部位有無紅斑和水腫等過敏反應(yīng)情況?？瞻讓?duì)照組與陽性對(duì)照組給藥方法均同受試藥物組。

2.3.2 結(jié)果判定及評(píng)價(jià):實(shí)驗(yàn)結(jié)果按衛(wèi)生部藥政管理局發(fā)布的《中藥新藥研究指南》皮膚過敏反應(yīng)程度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分,并計(jì)算平均分值。每只動(dòng)物皮膚過敏反應(yīng)程度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):無紅斑為 0分;勉強(qiáng)可見為 1分;中度紅斑為 2分;嚴(yán)重紅斑為 3分;紫紅色紅斑為 4分。無水腫為 0分;勉強(qiáng)可見為 1分;可見為 2分;皮膚隆起約 1mm,輪廓清楚為 3分;水腫隆起 1mm以上并范圍擴(kuò)大為 4分。進(jìn)行過敏反應(yīng)評(píng)分,計(jì)算出平均分值。致敏率分類按弱致敏性 (0～ 10%),輕度致敏性(20%～ 30%),中度致敏性(40%～60%),高度致敏性(70%～ 80%),極度致敏性(90%～100%)進(jìn)行。根據(jù)致敏率類別進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.3.3 結(jié)果:受試組和空白組各 8只豚鼠皮膚未出現(xiàn)紅斑和水腫,均為 0分;陽性對(duì)照組 8只豚鼠中 3只出現(xiàn)重度紅斑 3×3分,2只出現(xiàn)中度紅斑 2×2分,1只可見輕度紅斑為 1× 1分,2只豚鼠出現(xiàn)水腫并紅斑為 4×2分,陽性藥反應(yīng)總積分 22分,平均為 2.75分。陽性致敏物 2,4二硝基氯代苯動(dòng)物皮膚受試區(qū)自激發(fā)給藥 1h后出現(xiàn)紅斑,6h最明顯,24h逐漸消退,72h后紅斑仍可勉強(qiáng)看見,致敏達(dá) 100%。受試藥物柏硝祛毒洗劑組豚鼠皮膚受試區(qū)自激發(fā)給藥后 72h后未出現(xiàn)紅斑及水腫形成,與空白對(duì)照組比較無差別。

3 結(jié) 論 試驗(yàn)結(jié)果表明:柏硝祛毒洗劑對(duì)大鼠完整、破損皮膚均無急性毒性反應(yīng)。對(duì)白兔完整、破損皮膚無刺激性。對(duì)豚鼠皮膚不產(chǎn)生致敏反應(yīng),說明柏硝祛毒洗劑是安全的局部外用藥。

[1] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政管理局.新藥臨床前研究指導(dǎo)原則匯編 [M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1994:204-208.

[2] 孫敬方.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué) [M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002,191:374-375.

[3] 王北嬰,李儀奎.中藥新藥研制開發(fā)技術(shù)與方法[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社 ,2001:811-813.

[4] 徐淑云,卞如濂,陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué) [M].第二版.北京:人民衛(wèi)生出版社,1991:207-209.