穆曉麗，孫樂天，耿建軍，張 杰

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.太原動物園獸醫(yī)院，山西太原030009）

羊駝（alpaca）作為一種毛用型特種經(jīng)濟(jì)動物，毛色是該物種最主要的經(jīng)濟(jì)性狀[1]。內(nèi)皮素（endothelin，ET）是 1988 年 Yanagisawa等[2]從豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中分離到的一種血管活性多肽，是目前所知體內(nèi)最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)。研究表明，動物體內(nèi)有3種內(nèi)皮素基因，分別編碼3種ET異構(gòu)肽：ET-1，ET-2和ET-3。哺乳動物體內(nèi)的內(nèi)皮素受體（Endothelin receptor）有 A，B這2種類型，均屬于G蛋白偶聯(lián)受體。其中，內(nèi)皮素受體A（EDNRA）對ET-1，ET-2親和力強(qiáng)，而受體 B（EDNRB）對 ET-1，ET-2，ET-3 的親和力相同[3]。研究不同毛色羊駝皮膚中EDNRA的表達(dá)對羊駝毛色形成的影響，有助于深入了解內(nèi)皮素系統(tǒng)參與毛色形成的機(jī)理。

本研究擬從蛋白水平探討不同毛色中ED-NRA的表達(dá)差異，為研究EDNRA對羊駝皮膚黑色素生成及毛色形成的影響奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

選用毛色為白色和棕色的3歲雄性羊駝各3只（由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝養(yǎng)殖基地提供），取每只羊駝體側(cè)皮膚，剃毛刮凈后再用取皮器取直徑8mm羊駝皮膚組織各1塊，放置于4%的中性甲醛溶液中固定，以進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑、耗材及儀器

實(shí)驗(yàn)試劑為無水乙醇、二甲苯、苦味酸、甲醛、冰醋酸、APES黏片劑、0.01mol/LPBS緩沖液（pH 7.2～7.4）、丙酮、蘇木精、伊紅、中性樹膠、EDNRA多克隆兔抗人一抗（Boster，武漢）、單克隆小鼠抗兔二抗SABC試劑盒、DAB顯色液、5%BSA封閉液（Boster，武漢）等。

實(shí)驗(yàn)用耗材有石蠟塊、載玻片、蓋玻片、取皮器、紗布、切片刀等。

實(shí)驗(yàn)用儀器包括KD-BM生物組織包埋機(jī)、YD-335電腦切片機(jī)（浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠）、YD-A生物組織攤片機(jī)（浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠）、HPP-9160電熱恒溫培養(yǎng)箱、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋、DMLB型顯微鏡（LeiCa，德國）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

（1）將皮膚組織固定于Bouin氏固定液（飽和苦味酸水溶液75mL，40%甲醛25mL，冰醋酸5mL），固定24 h后，于70%酒精中充分沖洗。（2）組織塊浸入80%酒精2 h→85%酒精2 h→90%酒精1 h→95%酒精Ⅰ1 h→95%酒精Ⅱ1 h→無水酒精Ⅰ45min→無水酒精Ⅱ45min→無水酒精∶二甲苯（體積比為1∶1）20min→二甲苯Ⅰ30min→二甲苯Ⅱ30min→二甲苯Ⅲ30min；經(jīng)二甲苯透明后浸蠟2.5 h，包埋（脫水透明及包埋在 4℃進(jìn)行為宜）。（3）厚度 4～5μm，54～55℃攤片機(jī)展片，50℃烘片1 h。（4）二甲苯Ⅰ15min→二甲苯Ⅱ15min→無水酒精Ⅰ5min→無水酒精Ⅱ3min→95%酒精Ⅰ3min→95%酒精Ⅱ3min→90%酒精3 min→80%酒精2 min→70%酒精2 min→50%酒精2min→PBS緩沖液3min→3%雙氧水10min→PBS緩沖液5min，重復(fù)3次。（5）滴加5%BSA封閉液，37℃反應(yīng)30min，甩去多余液體，不洗。（6）滴加一抗工作液（1∶100），將切片置于濕盒，4℃反應(yīng)過夜后繼續(xù)在37℃反應(yīng) 1 h。（7）PBS洗 20min，重復(fù) 2 次，滴加二抗IgG，37℃反應(yīng) 30min。（8）PBS洗 5min，重復(fù) 3次，滴加 SABC，37 ℃ 30min，PBS洗 5min，重復(fù)3次。（9）取1mL蒸餾水，加入試劑盒中A，B，C試劑各1滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蒸餾水洗滌。（10）Mayor蘇木精復(fù)染，返藍(lán)，脫水，中性樹脂封片。（11）用PBS替代一抗作為陰性對照，用已知陽性切片作為陽性對照。染色陽性為細(xì)胞質(zhì)中存在棕黃色顆粒。

1.4 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

光鏡下觀察切片并采集圖片，將圖像輸入Image-Pro Plus6.0軟件中，對EDNRA在棕色和白色皮膚組織中的免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行光密度測定，每個(gè)樣本取5張切片，每張切片取5個(gè)視野，得到陽性細(xì)胞的平均光密度值。

將所得數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。不同樣本的細(xì)胞中光密度（OpticalDensity，OD）用One-way ANOVA單因素方差分析差異顯著，經(jīng)同質(zhì)性檢驗(yàn)不顯著，用多重比較LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，分析結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果

觀察免疫組織化學(xué)切片可見，內(nèi)皮素受體A在白毛組和棕毛組中均有表達(dá)，且二者在2個(gè)對照組切片里的皮膚毛乳頭細(xì)胞、毛根鞘細(xì)胞及表皮細(xì)胞層中均存在棕黃色陽性顆粒（圖1）。

2.2 圖像分析及統(tǒng)計(jì)結(jié)果

EDNRA在棕色毛和白色毛羊駝皮膚組織中的免疫組織化學(xué)結(jié)果經(jīng)圖像分析并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后顯示，所測數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布。軟件分析光密度值結(jié)果（表1）顯示，EDNRA只在毛根鞘處的表達(dá)差異顯著（P＜0.05）。

表1 EDNRA陽性表達(dá)組織的平均光密度（n=3）

3 討論

在胚胎發(fā)育過程中，黑素細(xì)胞（Melanocyte，Mc）的發(fā)育依次經(jīng)歷3個(gè)階段，即神經(jīng)嵴細(xì)胞、黑素母細(xì)胞和黑素細(xì)胞。黑素細(xì)胞從神經(jīng)嵴沿軀干側(cè)向遷移，而其他神經(jīng)嵴細(xì)胞則沿著軀干腹側(cè)部遷移，其定向分化與MITF，F(xiàn)GF-2，內(nèi)皮素以及諸多因子的作用相關(guān)[4-5]。內(nèi)皮素在黑素細(xì)胞的生長過程中有2個(gè)方面的重要作用，即調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞前體的數(shù)量并刺激黑素細(xì)胞前體向成熟黑素細(xì)胞分化[6]。在小鼠上，內(nèi)皮素可刺激其神經(jīng)嵴細(xì)胞表達(dá)早期的黑素母細(xì)胞的標(biāo)記物——多巴色素互變異構(gòu)酶，從而導(dǎo)致黑素母細(xì)胞的增殖和黑素生成[7]。當(dāng)小鼠ET-1或者EDNRA缺乏時(shí)，均表現(xiàn)為頭和心臟的神經(jīng)嵴細(xì)胞亞型的缺乏[8-9]。

有研究表明，EDNRA受體主要存在于心臟、主動脈和腦血管的平滑肌細(xì)胞（VSMC）中，發(fā)揮縮血管、促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織纖維化等作用[10]；在多種癌變組織中，EDNRA受體在原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)增加，提示EDNRA受體與這些腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移關(guān)系更為密切[11]。在本研究中，通過免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮素受體A在不同毛色皮膚中的毛乳頭細(xì)胞、毛根鞘細(xì)胞以及表皮細(xì)胞中均有分布；但是受體A僅在棕毛組皮膚的毛根鞘處有較高量的表達(dá)，其他部位的表達(dá)狀況與白毛組皮膚無異，這可能與該受體在正常動物體內(nèi)的主要分布狀況有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，EDNRA與羊駝毛色形成過程中黑素細(xì)胞的生成相關(guān)，但其在羊駝毛色形成調(diào)控過程中的作用還有待于進(jìn)一步的研究。

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