李健英，解 睿，李正莉，曹宇賓，郭俊宏

（山西省農(nóng)業(yè)科學院，山西太原030031）

玉米栽培歷史悠久，經(jīng)過長期的自然選擇和人工選擇，形成了極其豐富的種質資源，蘊含豐富的遺傳多樣性。大范圍的玉米地方品種資源的收集整理始于1943年，當時洛克菲勒基金會和墨西哥農(nóng)業(yè)部啟動了一個針對玉米品種資源的合作項目。從20世紀70年代開始，更多的國家開始玉米種質資源的收集工作。隨著種質資源收集工作的啟動與發(fā)展，種質資源數(shù)目的急劇增加，給資源的管理、評價、鑒定等工作造成了很大的障礙。針對這一問題，F(xiàn)rankel和Brown于1984年提出了基于遺傳多樣性構建核心種質的解決方案，為遺傳資源的研究和利用提供了嶄新的解決途徑。

1 玉米種質資源的收集與各國核心種質的構建研究

在世界主要的基因庫大約保存有65 000份玉米材料，90%是栽培玉米（Zmays）[1]。玉米的多樣性中心在中南美洲。CIMMYT有著世界上最大的玉米基因庫，保存有25 609份玉米材料，來自64個國家，其中21 767份來自中南美洲。據(jù)美國國家種質系統(tǒng)顯示，截止2009年11月底，美國保存有26 647份玉米種質材料，來自100多個國家。玉米15世紀傳入歐洲和亞洲，1996年歐洲農(nóng)作物遺傳資源網(wǎng)合作計劃在羅馬召開會議，建立玉米中心數(shù)據(jù)庫的提議得到16個參會國家18位代表的支持，會后在塞爾維亞Zemun Polje玉米研究所建立歐洲玉米數(shù)據(jù)庫，保存有13個國家11 865份玉米種質材料的信息。我國也具有豐富的玉米種質資源，截止到20世紀90年代末，我國所收集到的玉米地方品種已經(jīng)達到了玉米總資源的76.65%，在我國玉米種質庫中保存有17 000多份材料[2]。

構建核心種質受到了世界各國的廣泛重視。在對所保存種質資源試驗、鑒定、評價的基礎上，世界各國都開展了構建玉米核心種質的研究（表1）。拉丁美洲玉米計劃（LAMP）是第1個合作鑒定玉米種質資源的國際項目，共有巴西、玻利維亞、哥倫比亞、智利、危地馬拉、墨西哥、其有巴拉圭、秘魯、烏拉圭、委內(nèi)瑞拉、美國、阿根廷12個國家參加，項目第1期按玉米種族分組進行50多次試驗，鑒定7 312份材料，構建31個初級核心子集或育種核心子集[3]。歐洲啟動RESGEN CT96-088項目，對意大利、德國、法國、希臘、葡萄牙、西班牙以及荷蘭的玉米地方品種進行了表型多樣性評價，構建了各國核心種質，并在此基礎上進行分子多樣性評價，構建了歐洲玉米核心種質。CosmosMagorokosho[1]對津巴布韋、贊比亞、馬拉維收集的地方品種進行了表型和DNA水平上的多樣性鑒定，構建了核心種質。日本基于AFLP多態(tài)性，從保存在國家農(nóng)業(yè)科學研究所（NIAS）基因庫的300份和1 000份的玉米材料中分別選出17個北海道和69個其他材料構成日本玉米地方品種核心庫。中國農(nóng)科院依據(jù)所收集種質的基礎信息以及表型特性評價了中國國家種質庫中所收錄的13 521份地方品種和3 258份自交系，分別構建了核心種質庫[2]。在此基礎上，劉志齋[4]采用SSR標記構建了中國地方品種的微型核心庫。Yu等[5]分析了288個自交系（其中242個來自中國國家種質庫自交系核心庫）49個SSR位點的多態(tài)多樣性，構建了中國自交系微型核心子集。

表1 世界各國構建玉米核心種質研究及取樣策略

2 構建玉米核心種質的取樣策略研究

種質資源的多樣性不是隨機的，而是有一定的組織和結構。歸納核心種質的構建，實質上是將其結構進行分層，也就是分組、分類，深層地揭示其結構，并在此基礎上取樣。玉米核心種質構建偏重于取樣策略研究，即各種標準和方法在分類取樣中的應用。

2.1 構建數(shù)據(jù)的采用

核心種質構建通過基本信息數(shù)據(jù)和農(nóng)藝、形態(tài)性狀等數(shù)據(jù)的參與分析，利用各性狀的差異來剔除親緣關系相近的樣品并抽取核心樣品。各研究采用的性狀及其數(shù)目有所不同，巴西核心種質構建采用18個性狀數(shù)據(jù)[6]，CIMMYT育種核心子集的構建采用了15個性狀數(shù)據(jù)[7]。

各性狀對變異有不同的貢獻[8]，因此研究中還涉及到性狀的取舍。主成分分析是篩選用于構建核心種質性狀的一種方法，剔除對變異貢獻極小的性狀，去除冗余性狀對分析的影響，提高分析效率。MarcosMalosetti等[9]在構建核心種質時，對852份玉米種質的17個性狀的數(shù)據(jù)進行主成分分析，去掉6個與主成分不相關的變量，然后取11個性狀作為構建數(shù)據(jù)。一些研究也先后在核心種質的研究中證實了主成分分析去除冗余數(shù)據(jù)的有效性。

隨著分子生物學的發(fā)展，分子標記技術已被廣泛應用于種質資源的多樣性研究，從DNA水平上反映種質材料的遺傳差異。玉米核心種質構建也越來越趨向于利用分子標記數(shù)據(jù)，常用的分子標記技術有RFLP和SSR。

2.2 玉米核心種質第一層次分組標準

構建玉米核心種質庫，一般進行2個層次的分組（類），地理來源和粒型是第一層次分組的重要標準，其他有玉米種族、育種體系。

地理來源和粒型與遺傳多樣性密切相關。地理來源與多樣性分布的相關性已普遍得到認同。Malosetti指出，粒型與玉米馴化的不同階段有關，各粒型與玉米馴化不同階段的時間順序是爆裂—硬質—粉質—馬齒，馬齒是最現(xiàn)代的類型。從研究的空間分布也觀察到，爆裂玉米是離馬齒玉米最遠的小組，而其他粒型介于他們之間。而且研究也表明，遺傳特性的分布往往與生態(tài)地理區(qū)域是一致的?；诘乩韥碓春土Ｐ头纸M有其合理性，地理來源表示的是不同的進化方向，粒型表示的是不同的進化起源。

Malosetti在對構建烏拉圭地方種核心種質的取樣策略研究中，比較了玉米種族、地理來源、地理來源+粒型的分組標準，認為地理來源+粒型分組標準好于種族分組標準，并且所進行的判別分析也證實，地理來源+粒型表現(xiàn)出很高的正確分組[9]。

2.3 聚類方法研究

在第一層分類基礎上，采用什么樣的取樣策略一直是玉米核心種質研究中的一個熱點與重點。成功的取樣策略取決于聚類方法、遺傳距離算法、組（類）內(nèi)取樣量計算方法、組內(nèi)取樣方法。聚類方法的目的是尋找數(shù)據(jù)中潛在的自然分組結構，不加權類平均法（UPGMA）和離差平方和法（Ward）是構建玉米核心種質采用的2種主要方法。

聚類方法對構建結果的影響是構建玉米核心種質的重要研究內(nèi)容。Rincon等[10]用墨西哥2個地點2年的玉米田間試驗數(shù)據(jù)比較了4種聚類方法——UPGMA、最短距離法、重心法和Ward方法。評價時使用2組數(shù)據(jù)，不同類型和數(shù)目的性狀，平均的平方歐氏距離作為相異性量度，在性狀類型和數(shù)目不同的情況下，UPGMA對類的劃分是一致的，而且，同最短距離法和Ward方法比較，UPGMA表現(xiàn)出較高的同表象相關系數(shù)。Franco的比較研究也表明，對于距離算法，UPGMA總是優(yōu)于Ward，所構建的核心子集有顯著的多樣性[11]。

單一的方法并不是最好的解決方案，玉米核心種質構建中的一個趨勢是各種方法的結合應用，如聚類分析與主成分分析或判別分析結合應用，用主成分分析證實聚類結果并且研究分組的空間關系。再如基于距離和基于模型的聚類方法結合應用，吸納二者的特點，進行互補，最終使聚類方法具有統(tǒng)計性質，從而形成更好的解決方案。基于距離和基于模型聚類方法的結合經(jīng)歷了一步步地發(fā)展與改進，從Ward-Gaussian混合模型到Ward-LM模型再到Ward-MLM模型，解決了Gaussian模型只能利用連續(xù)變量、LM模型沒有考慮到大數(shù)據(jù)集經(jīng)常會出現(xiàn)空單元的問題。

Ward-MLM方法是Franco等[12]在玉米核心種質構建中提出的，又叫兩步Ward-MLM分類策略。第1步使用系統(tǒng)聚類方法Ward方法分組，第2步通過MLM模型改進、優(yōu)化第1步劃分的小組，其中采用了2種規(guī)則，upper-tail方法（也叫Mojena指數(shù)）和最大似然比檢驗。MLM模型在形狀、方向和體積上優(yōu)化在多維空間中所分布的點群（Ward方法獲得）。

Ward-MLM分類策略用Gower距離度量樣品間的相似性，把分類變量結合在一個多項式變量中，實現(xiàn)了連續(xù)變量和有序變量同時參與分析。這一策略的特點是：（1）優(yōu)化目標函數(shù)，如第1步中的組內(nèi)平方和，第2步中的似然函數(shù)；（2）進行統(tǒng)計檢驗確定最佳的小組數(shù)目；（3）可以度量所分組的質量和確定組內(nèi)成員身份的概率；（4）同時考慮到連續(xù)變量和分類變量的重要性，包括所有可以利用的信息，沒有變量被排除在分析之外[13]。Ward-MLM策略可以同時使用表型數(shù)據(jù)和遺傳標記數(shù)據(jù)，如果只使用分子標記和DNA片段數(shù)據(jù)，可采用各種聚類方法和各種距離度量。

Franco等[14]還把Ward-MLM法擴展到了基因型×環(huán)境×性狀的三向數(shù)據(jù)分類分析中，并比較了兩步Ward-Gaussian方法和兩步Ward-MLM方法，研究證實，連續(xù)變量和分類變量在最后的分組中都有其重要性；比較研究表明，基于連續(xù)變量構成的小組沒有清楚地表現(xiàn)出分類變量的反應模式，而基于連續(xù)變量和分類變量構成的小組則明顯地表現(xiàn)出2種變量的反應模式。兩步Ward-MLM方法能夠很好地恢復模擬數(shù)據(jù)的結構，所劃分的加勒比玉米材料組與地理來源有很明顯的關聯(lián)。Franco等[15]2002年對2組玉米數(shù)據(jù)和1組小麥數(shù)據(jù)的研究表明，三向Ward-MLM聚類所劃分的組在各環(huán)境下有相似的性狀反應，獲得了交叉互作小的同質組。

2.4 組（類）內(nèi)取樣量計算方法研究

在取樣策略中，組（類）內(nèi)取樣量計算方法決定從類內(nèi)抽取樣品的數(shù)目。研究中提出多種組（類）內(nèi)取樣量計算方法，有R方法、C方法、L方法、P方法，隨著分子標記數(shù)據(jù)的采用，后來又提出H方法和M方法。L方法和P方法是構建玉米核心種質常用的方法。

研究表明，P方法偏重于容量大的組（類），L方法偏重于容量小的組（類），L方法高度取決于分組方法。Schoen和Brown使用估計位點和目標位點數(shù)據(jù)比較了6種組（類）內(nèi)取樣量計算方法，結果表明，按從高到低的排列，期望的等位基因保持率為M＞H＞P＞L＞C＞R[16]。

組（類）內(nèi)取樣量計算方法可以分為2類：基于組（類）容量，基于多樣性。Franco提出的D方法則屬于后者，每類的取樣量與類內(nèi)樣品間Gower距離的平均值成比例，也就是取樣量與平均Gower距離度量的組內(nèi)多樣性成比例，其原則是多樣性大的組其平均Gower距離也大，因此，所取樣品量也應較多。D方法可以使用任何聚類方法和任何距離量度。

Franco采用的4組數(shù)據(jù)集（危地馬拉玉米種質、巴西玉米種質、墨西哥玉米種質、Pool25（S2品系與一測交種雜交））樣品量大小不一，多樣性值不同，而且類的數(shù)目也不同，采用Ward-MLM策略，進行了D方法與其他方法的比較。根據(jù)樣品的多樣性、樣品變量極值的恢復、樣品的方差3個標準，D方法所構建核心種質樣品間的平均Gower距離大，恢復的變量極值多，核心種質方差也大，而且都顯著。D方法是一種有效的方法，保存了原群體的多樣性，適合成為構建核心種質的一個標準[17]。

2.5 多因素綜合比較

為了研究各因素對取樣策略的影響，F(xiàn)ranco等[18]進行了綜合研究，比較了2種聚類方法UPGMA和Ward，2種遺傳距離算法修正的Roger（MR）及Cavalli-Sforza和Edwards（CE），6種組（類）內(nèi)取樣量計算方法P，L，D-修正的Rogers或 D-Cavalli-Sforza（D-MR 或 D-CE）、D-Shannon index（D-SH，與Shannon多樣性指標成比例）、D-Heterozygous（D-HE，與每一個體雜合位點的期望比成比例）、D-Effective alleles（D-NE，與有效等位基因數(shù)目成比例）共24個組合，采用分子標記數(shù)據(jù)，3組數(shù)據(jù)集，即混合數(shù)據(jù)集來自美國和歐洲的玉米地方品種，種質數(shù)據(jù)集來自墨西哥的地方品種，群體數(shù)據(jù)集把墨西哥的地方品種每一群體的個體分組，計算每一群體的等位基因頻率。

研究的評價標準是核心子集樣品間平均遺傳距離最大（MRs或CEs），等位基因豐度最大（SHs，HEs和 NEs），無信息等位基因（none-informative allele）比例最小（PNs）。對于混合數(shù)據(jù)集，核心子集樣品間平均遺傳距離（MRs和CEs）主要受組內(nèi)取樣量計算方法和聚類方法影響，受聚類方法×組內(nèi)取樣量計算方法互作和聚類方法×距離互作影響較小。對于多樣性指數(shù)（SHs，HEs和NEs）聚類方法×距離是變異性的重要來源。對于種質數(shù)據(jù)集，聚類方法的主效應是所有反應變量變異性的重要來源，其次是聚類方法×組內(nèi)取樣量計算方法互作和組內(nèi)取樣量計算方法主效應。多樣性指數(shù)SHs和NEs主要受聚類方法×距離互作影響，MRs，CEs和HEs受其影響較小。PNs僅受聚類方法影響。

3 組數(shù)據(jù)集的研究結果表明，對于評價標準MRs和CEs，UPGMA總是優(yōu)于Ward；CE距離優(yōu)于MR距離；最好的組內(nèi)取樣量計算方法是D-MR，D-CE或D-NE。

研究還與M方法進行了比較，結果表明，M方法能夠有效地構建等位基因豐度高、無信息等位基因比例低的核心種質。按遺傳距離最大化的評價標準（育種家的角度），D方法總是優(yōu)于M方法；按遺傳多樣性的評價標準（分類學家角度），D方法相似或次于M方法。

2.6 針對特殊目的的核心種質構建

依據(jù)形態(tài)性狀構建的核心庫并不能很好地捕捉與玉米籽粒特性有特殊關聯(lián)的變異。Campbell等[19]嘗試了另外的方法，對306份智利低地亞熱帶和溫帶玉米群體利用近紅外透射光譜法構建以玉米籽粒品質為目的的核心種質，樣品的平均頻譜轉換為對數(shù)，然后再用多元散射校正轉換，最后進行主成分分析。

用第一主成分和第二主成分作圖，將圖人為地分割為5×5格，共有25個單元，在同一單元內(nèi)的樣品具有相似的頻譜，因而認為其具有相似的品質特性，有冗余，從每一單元的中央取一樣品構成有16個樣品的核心種質，具有多樣性。

3 深層次研究各方法的優(yōu)點、局限性及有效性

合理有效的取樣策略是構建核心種質的關鍵，雖然玉米核心種質的研究有很大進展，但對于不同遺傳距離、不同的系統(tǒng)聚類方法及不同抽樣方法構建核心種質的優(yōu)點與局限性及有效性還需深入研究。例如，參與分析的性狀及其數(shù)目對分析結果的影響；距離算法對分類的影響；各種層次或水平上的數(shù)據(jù)，如生態(tài)、生物化學、分子標記等數(shù)據(jù)的結合應用，以使核心種質的構建結果更加可靠。

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