黃海波,陳味味,陳 偉,李 娟,李雪頔,劉群英

(江南大學(xué) 1.醫(yī)藥學(xué)院 生物制藥系;2.校醫(yī)院,江蘇 無錫 214122)

蟹類是我國市場上最常見的甲殼類水產(chǎn)食品,也是常見引起食源性過敏疾病的食物之一[1-2]。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和物質(zhì)生活水平的不斷提高,我國食源性過敏疾病的發(fā)病率也呈上升趨勢,因此,食物過敏已經(jīng)成為食品安全問題之一[3]。本文以中華絨螯蟹過敏原蛋白提取物為診斷抗原,采用ELISA間接法檢測1907例人群血清中的特異性IgE,比較分析不同人群對蟹類食物的過敏反應(yīng)性,為蟹類食物過敏癥的臨床診斷與防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血清樣品

1907例人群血清從江南大學(xué)校醫(yī)院收集,其中2008級本科入學(xué)新生1379例,2008級浙江大學(xué)遠(yuǎn)程學(xué)生158例,2008年本校職工體檢370例,樣品收集時間為2008年9月至11月。

1.2 試劑與儀器

辣根過氧化物酶(HRP)-羊抗人IgE為美國KPL公司產(chǎn)品;牛血清白蛋白(BSA)、3′,3′,5′,5′,-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、過氧化脲均為加拿大BBI公司產(chǎn)品;MK3型酶標(biāo)儀為美國熱電公司產(chǎn)品。

1.3 蟹過敏原蛋白提取物制備

取鮮活的中華絨螯蟹(購自無錫水產(chǎn)品市場)去除甲殼,挑取純凈肌肉組織用勻漿機勻漿后,按體積比1∶15的比例加入丙酮,置4℃冰箱脫脂,每天換液1次,期間攪拌2 h。48 h后濾去丙酮,干燥后稱重,每1 g樣品加入0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)15 mL,置4℃48 h,期間每天攪拌 2 h。4℃,12000 r/min離心20 min,收集上清,取樣測定蛋白濃度,其余置-35℃保存。

1.4 酶標(biāo)反應(yīng)板預(yù)包被與血清特異性IgE的檢測

酶標(biāo)反應(yīng)板預(yù)包被與封閉:蟹過敏原蛋白提取物用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)調(diào)整濃度至5 μ g/mL,包被96孔酶標(biāo)反應(yīng)板,50 μ L/孔(250 ng/孔),37 ℃孵育1 h,置4℃過夜,次日用PBS洗滌5次,加1%BSA封閉液220 μ L/孔,37 ℃孵育3 h,置4 ℃過夜,次日用PBS洗滌5次,密閉置4℃?zhèn)溆谩?/p>

血清特異性IgE檢測:取待檢血清加入預(yù)包被的酶標(biāo)反應(yīng)板,50 μ L/孔;每塊反應(yīng)板設(shè)置空白孔,加入酶標(biāo)抗體稀釋液50 μ L/孔。置37℃溫箱孵育30 min,用PBS洗滌5次;加入1∶2000稀釋的HRP-羊抗人IgE,50 μ L/孔,37℃溫箱孵育 30 min,用PBS洗滌5次;加底物TMB和過氧化脲顯色15 min,1 mol/L硫酸終止反應(yīng),以空白孔調(diào)零測定A450值。

1.5 陽性/陰性判定值(Cut off)的確定

從本院學(xué)生中選擇10例已知無任何食物和藥物過敏史的健康志愿者,采集血清樣品按1.4項下方法操作,測定 A450值,計算Cut off值。Cut off值=Σ A450/10×3。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用χ2檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 蟹過敏原蛋白提取物制備

經(jīng)脫脂處理和PBS提取得到的蟹過敏原蛋白溶液,蛋白濃度為4.3 mg/mL。

2.2 血清特異性IgE的檢測與分析

3組人群共1907例血清樣本的特異性IgE檢測結(jié)果見表1,統(tǒng)計學(xué)分析顯示,不同人群組之間血清中蟹過敏原特異性IgE陽性率有極顯著差異(χ2=121.29,P＜0.01)。組間分析表明,教職工組人群的血清特異性IgE陽性率顯著高于兩組學(xué)生人群(教職工組與2008級學(xué)生組之間χ2=114.13、與浙大遠(yuǎn)程學(xué)生組之間χ2=27.65,P＜0.01),而兩組學(xué)生人群之間血清特異性 IgE陽性率無差異(χ2=0.07,P＞0.05)。

表1 3組人群血清中蟹過敏原特異性IgE的檢測結(jié)果Tab.1 The detection results of specific IgE to crab allergic protein in the sera from three group people

2.3 Cut off值的確定

根據(jù)10例志愿者血清特異性IgE測定的A450值(見表2),計算的Cut off值為0.159。

表2 10例健康志愿者血清特異性IgE檢測結(jié)果Tab.2 The results of specific IgE detection of the sera from healthy volunteer

3 討 論

近年來,食品安全日益受到國內(nèi)外的廣泛重視。在食源性疾病中,因食物中的過敏原引起的過敏反應(yīng)是一大類常見的臨床疾病,對人們的身體健康和生命安全造成了很大的影響[4]。隨著食源性過敏疾病發(fā)病率的上升,食物過敏癥的診斷與防治成為我國醫(yī)藥科研的新內(nèi)容之一。

因進(jìn)食蟹類食品引起的超敏反應(yīng)疾病包括過敏性紫癜、蕁麻疹、過敏性哮喘、過敏性胃腸炎、過敏性鼻炎等。宋紅霞等[5]對120例過敏性紫癜患者分析特異性IgE結(jié)果表明,蛋白食物組過敏原以蝦/蟹陽性率最高(15.8%),許等[6]也發(fā)現(xiàn)過敏性紫癜患者中食入組過敏原陽性率以蝦、蟹居首位。因進(jìn)食蟹類食物發(fā)生嚴(yán)重過敏者甚至發(fā)生過敏性休克[7]。

過敏性疾病的發(fā)生除了具有個體遺傳差異之外,還具有明顯的地域特點,與患者的生活居住環(huán)境、變應(yīng)原物種、以及過敏原接觸史等密切相關(guān)。本文針對蟹類過敏原特異性IgE的檢測結(jié)果也顯示,不同人群中蟹過敏原特異性IgE的檢出率有顯著差異。3組人群中,江南大學(xué)學(xué)生來自除西藏、香港、澳門、臺灣以外的全國30個省市和自治區(qū),浙大遠(yuǎn)程學(xué)生主要來自江蘇省南部地區(qū)(無錫、宜興、江陰、鎮(zhèn)江、揚州),而兩組學(xué)生人群之間血清特異性IgE陽性率無差異(P＞0.05),表明蟹類食物過敏癥在國內(nèi)人群的地域特點不明顯;教職工生活居住在當(dāng)?shù)?但教職工人群血清的特異性IgE陽性率顯著高于學(xué)生人群的陽性率(P＜0.01)。筆者分析認(rèn)為,由于學(xué)生人群的飲食主要集中在食堂,而學(xué)生食堂一般極少提供價格較高的蟹類菜肴,因此學(xué)生人群接觸蟹類過敏原的機會相對較少;教職工主要為家居飲食而且條件較優(yōu)裕,接觸蟹類過敏原的機會相對較多。由此提示,蟹類食物過敏癥的發(fā)生主要與個體差異和人群的飲食條件密切相關(guān)。

目前,我國臨床上對各種過敏性疾病的實驗診斷,主要采用過敏原體外檢測法和特異性IgE體外檢測法,使用的檢測試劑主要依賴進(jìn)口,如美國ASI公司生產(chǎn)的IVT過敏原體外檢測試劑盒[8]。鑒于變應(yīng)原物種的差異和過敏性疾病的地域特點等因素,有必要研究開發(fā)適合我國地域特點和人群的過敏性疾病診斷試劑,實現(xiàn)檢測試劑的國產(chǎn)化。本文結(jié)果表明,以蟹過敏原蛋白提取物為抗原檢測血清特異性IgE具有診斷意義,可為臨床蟹類食物過敏癥的診斷和防治提供實驗診斷依據(jù)。

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