楊 青,武繼彪,2,張岫美

(1.山東大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)研究所,山東 濟南 250012;2.山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校,山東 萊陽 260062)

隨著對腦缺血再灌注損傷后病理生理機制研究的不斷深入,近年來與腦缺血有關(guān)的炎癥反應(yīng)及其損傷作用日益受到關(guān)注。以往研究表明丹皮酚(paeonol)能抑制由缺血再灌注損傷所致的ICAM-1及VCAM-1表達的上調(diào),通過降低黏附分子表達減輕大鼠腦缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)而發(fā)揮腦保護作用[1]。本研究采用線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,擬通過觀察丹皮酚對腦缺血后腦組織及血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)的影響,進一步探討其腦保護作用機制,為臨床藥物開發(fā)及應(yīng)用提供理論依據(jù)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

丹皮酚注射液(寧波天真制藥有限公司,批號H33020043);TNF-α、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑盒,TNF-α、IL-1β免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 動物

健康雄性Wistar大鼠100只,體重220～280 g,SPF級,由山東大學(xué)實驗動物中心提供,合格證號:SCXK(魯)20030004。

1.3 儀器

DDL-5型冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);318-MC型酶標儀(上海三科儀器有限公司);Leica RM-2235石蠟組織切片機(德國徠卡公司);HL-2BL病理組織漂洗處理儀(上海和利實業(yè)有限公司)。

1.4 實驗分組及給藥

健康雄性Wistar大鼠100只,隨機分成5組,即假手術(shù)組、模型組、丹皮酚低(15 mg/kg)、中(20 mg/kg)、高(30 mg/kg)給藥組,腹腔注射給藥,1次/d,連續(xù)8 d。假手術(shù)組、模型組腹腔注射等容量生理鹽水。末次給藥后2 h手術(shù)造模。

1.5 大鼠局灶性腦缺血模型制備

根據(jù)改良的Longa方法制成大腦中動脈閉塞模型。大鼠稱重后用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后,仰臥固定于恒溫手術(shù)臺上,作頸部正中皮膚切口,鈍性分離各層組織,暴露左側(cè)頸總動脈及分支,在頸總動脈分叉處結(jié)扎頸外動脈。結(jié)扎頸總動脈近心端,在其上用眼科剪剪一V形小口,并將準備好的線栓從切口插入,線栓進入頸內(nèi)動脈穿過大腦中動脈起始端至大腦前動脈近端,阻斷大腦中動脈的血流。缺血2 h后,將線栓拔出實現(xiàn)再灌注,再灌注時間為22 h。假手術(shù)組手術(shù)過程同模型組,但不阻塞血管。

1.6 神經(jīng)行為學(xué)評分

大鼠清醒后,觀察其行為學(xué)變化,按照Zea等的5分法標準,0分:無神經(jīng)缺損癥狀;1分:右前肢不能完全伸直;2分:向右側(cè)旋轉(zhuǎn);3分:向右側(cè)傾倒;4分:不能自己行走或昏迷。

1.7 缺血側(cè)腦組織TNF-α、IL-1β的測定

再灌注22 h大鼠經(jīng)生理鹽水及多聚甲醛液灌流后開顱取缺血側(cè)腦組織,常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋后,采用視交叉前緣作3 mm厚冠狀切片,常規(guī)制片(4 μ m厚),采用免疫組化法測定,操作按試劑盒說明書進行。每1只動物取連續(xù)切片2張,分別用于測定TNF-α和IL-1β。每1張切片在 40×10倍視野下隨機選取梗死周邊區(qū)不重疊的5個視野,分別計數(shù)TNF-α和IL-1β陽性細胞數(shù)。

1.8 血清中TNF-α、IL-1β的測定

缺血2 h再灌注22 h后,腹主動脈取血后離心分離出血清,于-20℃冷凍保存,待用。按照ELISA試劑盒測定。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件處理,計量資料以()表示。方差齊時采用單因素方差分析,方差不齊時采用F檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 丹皮酚對腦缺血再灌注損傷后大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分的影響

模型組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分較假手術(shù)組顯著增高(P＜0.01),丹皮酚中、高劑量組較模型組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分顯著降低(P＜0.01～0.05),其中以丹皮酚高劑量組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分降低尤為顯著,見表1。

2.2 丹皮酚對缺血再灌注大鼠腦組織TNF-α、IL-1β的影響

免疫組化染色陽性結(jié)果為胞漿呈棕色顆粒樣。假手術(shù)組僅偶見TNF-α和IL-1β表達,模型組可見大量胞漿呈棕色的陽性細胞,TNF-α和IL-1β含量明顯增高,與假手術(shù)組相比有顯著性差異(P＜0.01)。與模型組相比,丹皮酚中、高劑量組TNF-α和IL-1β陽性細胞數(shù)量明顯減少(P＜0.01)。結(jié)果見表1和圖1～2。

2.3 丹皮酚對缺血再灌注大鼠血清TNF-α、IL-1β的影響

與假手術(shù)組比較,模型組血清TNF-α和IL-1β含量明顯升高(P＜0.01);與模型組比較,丹皮酚中、高劑量組血清TNF-α和IL-1β含量明顯降低,差異有顯著性(P＜0.01～0.05)。見表1。

3 討 論

表1 丹皮酚對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分,腦組織和血清TNF-α、IL-1β的影響(n=10,)Tab.1 Effect of Paeonol on neurological deficit,TNF-α、IL-1β in the brain and serum after MCAO injury in rats(n=10,)

表1 丹皮酚對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分,腦組織和血清TNF-α、IL-1β的影響(n=10,)Tab.1 Effect of Paeonol on neurological deficit,TNF-α、IL-1β in the brain and serum after MCAO injury in rats(n=10,)

與假手術(shù)組比較:1P＜0.05,2P＜0.01;與模型組比較:3P＜0.05,4P＜0.01 1P＜0.05,2P＜0.01 vs sham group;3P＜0.05,4P＜0.01 vs model group

組別 劑量/(mg/kg)神經(jīng)行為學(xué)評 分TNF-α陽性細胞數(shù)/(cells/mm2)IL-1β陽性細胞數(shù)/(cells/mm2)TNF-α/(ng/mL)IL-1β/(ng/mL)假手術(shù)組 - 0 7.00±2.09 6.33±1.50 1.41±0.28 0.299±0.053模型組 - 2.50±0.542 40.33±8.352 39.50±7.712 2.83±0.352 0.481±0.0622丹皮酚低劑量組 15 2.16±0.40 34.50±3.50 33.66±3.50 2.64±0.29 0.402±0.071丹皮酚中劑量組 20 1.66±0.513 27.33±2.064 28.16±1.724 1.99±0.224 0.361±0.0703丹皮酚高劑量組 30 1.33±0.514 18.83±3.064 19.00±3.224 1.73±0.194 0.323±0.0514

腦缺血后可導(dǎo)致神經(jīng)細胞的變性、壞死,功能下降,血流的再灌注一方面對于功能的恢復(fù)非常重要,另一方面又會使組織損傷進一步加重,即再灌注損傷。缺血再灌注早期的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致繼發(fā)性腦損害的重要原因。內(nèi)皮細胞、神經(jīng)元和血管周圍的炎性細胞被激活,釋放炎性細胞因子,這些炎性細胞因子促進了缺血性損傷向炎癥性損傷轉(zhuǎn)變。TNF-α、IL-1β為急性腦缺血再灌注損傷中主要的炎性細胞因子[2]。它們作為趨化因子,促使白細胞由血管內(nèi)向缺血區(qū)腦組織遷移,使腦組織損傷加重[3-4]。

TNF-α、IL-1β過表達介導(dǎo)了腦缺血再灌注的炎癥反應(yīng)和一系列與之相關(guān)的興奮性氨基酸神經(jīng)毒、毒性氧化自由基、酸中毒等反應(yīng),這些物質(zhì)共同作用的后果引起或加重神經(jīng)細胞壞死或凋亡、腦組織損害[5]。因此,抑制這些炎性細胞因子的釋放,拮抗其作用,對于減輕腦組織損傷意義重大。

丹皮酚又稱牡丹酚,是從蘿摩科植物徐長卿干燥根或全草和毛茛科芍藥屬植物牡丹的根皮中提取出來的活性成分,臨床上主要應(yīng)用其抗炎作用治療神經(jīng)痛、風(fēng)濕痛及某些變應(yīng)性疾病[6]。隨著對丹皮酚研究的不斷深入,其對于腦損傷的保護作用受到廣泛關(guān)注。丹皮酚能縮小缺血再灌注損傷大鼠的腦梗死體積,降低病理組織損傷,使神經(jīng)元壞死程度減輕,存活數(shù)量增多,間質(zhì)水腫減輕。對腦缺血再灌注損傷后的腦組織有明確的保護作用[7-8]。

本研究分別測定了腦組織和血清中TNF-α、IL-1β,進行了定性和半定量的分析,從表1可看出,大鼠腦缺血再灌注損傷后,腦組織切片中TNF-α、IL-1β陽性細胞數(shù)明顯增多,血清中TNF-α、IL-1β水平明顯升高。而預(yù)先給予丹皮酚可顯著降低其水平,改善腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)缺陷癥狀,并且作用隨劑量的增加而更加明顯,提示丹皮酚可通過影響炎癥因子TNF-α、IL-1β在腦缺血再灌注時的炎癥反應(yīng)過程,減輕腦缺血炎癥、改善神經(jīng)功能而發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。

[1]張碩,高海青,張岫美.丹皮酚抑制大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷腦組織細胞間黏附分子-1和血管細胞黏附分子-1的表達[J].中國生化藥物雜志,2008,29(1):5-8.

[2]Offner H,Subramanian S,Parker S M,et al.Experimental stroke induces massive,rapid activation of the peripheral immune system[J].J Cereb Blood Flow Metab,2006,26(5):654-665.

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[5]柳洪勝,張允嶺,劉雪梅.從局灶腦缺血再灌注炎癥因子的動態(tài)變化探討內(nèi)毒形成及作用[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2007,30(4):246-248.

[6]章靈華,肖培根,黃芝,等.丹皮酚的藥理與臨床研究進展[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,1996,16(3):187-189.

[7]武繼彪,隋在云,管華詩.丹皮酚對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2008,9(26):1887-1888.

[8]孫文芳,高素潔,高金霞,等.丹皮酚對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用[J].中國臨床康復(fù),2004,16(8):3088-3089.