楊小明,趙冬梅,杜秋江,李語如

(1.江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司 研究所,江蘇 連云港 222002;2.連云港職業(yè)技術學院,江蘇 連云港 222005)

比伐盧定是一種人工合成的二十肽衍生物,為一新型凝血酶抑制劑,與凝血酶的結合是可逆的,大大降低了臨時抗凝帶來的出血風險,使得該藥在高?；颊咧幸驳玫搅藦V泛的應用,取得了較好的臨床應用效果[1]。

在比伐盧定的合成工藝中,為保護比伐盧定的氨基游離而遭受氧化而變質[2],最后一步是將比伐盧定制成三氟乙酸鹽,以保證比伐盧定的質量。通過檢測比伐盧定中三氟乙酸的含量,來保證其均已成鹽(全部成鹽后,三氟乙酸理論含量為9.5%)。本實驗建立了高效液相色譜法(HPLC)測定比伐盧定中三氟乙酸含量的方法。

1 材 料

比伐盧定,江蘇豪森醫(yī)藥股份有限公司研究所提供,批號:20061229、20070213、20070428、20070629;三氟乙酸對照品(色譜純),美國天地試劑有限公司;甲醇(色譜純),江蘇漢邦科技有限公司;其余試劑均為市售分析純。

美國Waters Alliance 2695高效液相色譜儀,2487紫外可變波長檢測器,Empower 2色譜工作站。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Hanbon Kromasil C18(4.6mm×200mm,5 μ m);流動相:0.07%磷酸溶液(pH 3.0)-甲醇(98∶2);流速:1.0 mL/min;檢測波長:210 nm;柱溫:30 ℃;進樣量 :20 μ L。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的配制 取三氟乙酸對照品適量,精密稱定,加流動相溶解并制成每1 mL中含三氟乙酸500 μ g的溶液,作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制 取比伐盧定適量,精密稱定,加流動相溶解并制成每1 mL中含比伐盧定5 mg的溶液,作為供試品溶液。

2.3 測定方法

精密量取對照品溶液和供試品溶液各20 μ L,分別注入液相色譜儀。記錄色譜圖(見圖1),按外標法以峰面積計算供試品溶液中三氟乙酸的含量。

圖1 比伐盧定中三氟乙酸測定的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of trifluoroacetic acid content in bivalirudin

2.4 加樣回收率測定

用加樣回收法,精密量取供試品溶液5 mL,置10 mL量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,作為回收試驗用空白溶液(三氟乙酸濃度為252.5 μ g/mL),另精密量取三氟乙酸對照品溶液(含三氟乙酸2500 μ g/mL)0.8,1.0,1.2 mL各3份,分別置 10 mL量瓶中,用空白溶液稀釋至刻度,搖勻,作為回收率測定溶液,按2.3項方法分別測定,并計算回收率,測定結果見表1。平均回收率為99.9%,RSD(n=9)為0.41%。

表1 回收率試驗測定結果表Tab.1 Determination results of recovery rate

2.5 線性范圍

取三氟乙酸對照品適量,精密稱定,加流動相溶解并分別稀釋制成198.4,297.6,396.8,496.0,992.0 μ g/mL的溶液,依次進樣20 μ L,記錄色譜圖,以峰面積(Y)為縱坐標,濃度(X,μ g/mL)為橫坐標,進行線性回歸。回歸方程:Y=557.0 X-4783,r=0.9999,線性范圍為 198.4～992.0 μ g/mL。

2.6 精密度測定

取比伐盧定(批號20061229)適量,精密稱定,加流動相溶解并制成每1mL中含比伐盧定5mg的溶液,作為供試品溶液,共配制6份,按2.3項方法分別測定三氟乙酸的含量,平均含量為10.3%,RSD為0.56%。

2.7 檢測限

取三氟乙酸對照品適量,精密稱定,加流動相溶解并稀釋制成3.97 μ g/mL的溶液,進行測定,信噪比S/N=3,測得三氟乙酸的檢測限為40 ng。

2.8 比伐盧定中三氟乙酸含量測定

取比伐盧定4批(批號:20061229、20070213、20070428、20070629),按2.3項方法測定三氟乙酸的含量,結果分別為10.1%,11.5%,9.6%,10.2%。

3 討 論

目前三氟乙酸含量測定的方法多采用氣相色譜法[3],由于三氟乙酸的極性大,酸性強,對氣相色譜柱損傷大,分析成本較高,且效果不很理想。而用氧瓶燃燒法測定氟的含量[4-5],操作繁瑣且誤差較大。另據(jù)報道[2],也可考慮用強酸型陽離子交換色譜柱測定三氟乙酸的含量,本文采用C18色譜柱分離測定比伐盧定中三氟乙酸的含量,方法簡便,準確度高。

在三氟乙酸對照品的配制過程中,因三氟乙酸極易揮發(fā),故在稱量過程中,量瓶內應先加入適量流動相,再加入三氟乙酸后需充分振搖,使三氟乙酸充分溶解于流動相中,減量法稱樣比較準確。

在整個試驗過程中,比伐盧定主峰未能洗脫出來,多次進樣尚未發(fā)現(xiàn)其對三氟乙酸測定有干擾,但每次試驗完成后,應對色譜柱進行清洗后再保存。

[1]Rhas W,Kuchulakanti P K,Pakala R,et al.Bivalirudin versus heparin as an antithrombotic agent in patientswho undergo percutaneous saphenous vein graft intervention with a distal protection device[J].Am J Cardiol,2005,96(1):67-70.

[2]高春,高恒瑩,姚瑛,等.高效液相色譜法測定醋酸奧曲肽中醋酸含量[J].中國生化藥物雜志,2004,25(4):237-238.

[3]孟靜娟,單風平.氣相色譜法測定液相合成蛋酸腦啡肽中雜質殘留量[J].微生物學雜志,2008,28(3):106-108.

[4]顏冬梅.人發(fā)中微量氟的測定[J].醫(yī)療保健器具,2008,15(9):74-75.

[5]張莉,晁若冰.有機藥物中殘留三氟醋酸測定方法的研究[J].華西藥學雜志,2001,16(6):427-428.