邸云峰 韋麗華 焦玉蓉 王樹人

(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)與法醫(yī)學(xué)院病理生理教研室,四川 成都 610041)

阿爾茨海默爾病(Alzheimer's disease,AD)和動脈粥樣硬化(AS)同屬老年性疾病,年齡的增長是其發(fā)病率明顯上升的共同高危因素,研究發(fā)現(xiàn)AD的重要致病因素β淀粉樣蛋白參與AS中巨噬細(xì)胞的活化[1],而巨噬細(xì)胞的活化是AS發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制。隨后的一系列研究進(jìn)一步顯示,β淀粉樣蛋白前體的生成可能是AD和AS共同的發(fā)病環(huán)節(jié)[2-4]。關(guān)于β淀粉樣蛋白對AS形成的影響及其機(jī)制的研究巳涉及到多個環(huán)節(jié),如膽固醇聚集,炎癥,載脂蛋白E,血管緊張素系統(tǒng),血小板,肝的X受等等[5,6]。而對于可以導(dǎo)致AD發(fā)生的另一重要蛋白：Tau蛋白是否對AS的形成有促進(jìn)作用國內(nèi)外尚甚少文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以參與AS病變發(fā)生的主要細(xì)胞-巨噬細(xì)胞為研究對象,探討激活的巨噬細(xì)胞是否生成過磷酸化的 Tau蛋白,并以崗田酸刺激磷酸化Tau蛋白的生成,觀察其是否對β淀粉樣蛋白生成、及對膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體：三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)的表達(dá)產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

人單核細(xì)胞株 T HP-1由本室保存;鼠抗人Anti-β-amyloid(1-40)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);兔抗人Phospho-Tau(T231)抗體與Phospho-Tau(S396)抗體(Signalway Antibody(SAB));Kadaic acid(OA)以及佛波酯(PMA)(Sigma);逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)試劑盒(TIANGEN公司);免疫組化試劑盒(北京中杉);總蛋白提取試劑盒(凱基公司);其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 洗滌濃縮血小板的提取

取3.8%枸櫞酸鈉抗凝血采血管采健康人靜脈血10mL,24℃,3000r?min-1離心12min,取上部富含血小板血漿,1300r?min-1離心5min、洗滌(等體積無菌生理鹽水),1300 r?min-1離心 5min,離心后重懸于無血清RPM I 1640培養(yǎng)基中即為洗滌濃縮血小板。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

THP-1細(xì)胞用含 10%小牛血清 RPM I 1640培養(yǎng)液,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)液中加青霉素和鏈霉素各105U?L-1,在每次實(shí)驗(yàn)前用160nmol?L-1PMA孵育THP-1單核細(xì)胞36 h,使其誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞。后換為無血清1640培養(yǎng)基。

THP-1源性巨噬細(xì)胞與洗滌濃縮血小板(108每0.5×106巨噬細(xì)胞)孵育48h,對照組不加血小板單獨(dú)孵育48h[1]。將與血小板共同孵育后的細(xì)胞隨機(jī)分為：對照組：不加OA;4 nmol?L-1OA組;8 nmol?L-1OA組;16 nmol?L-1OA組;32nmol?L-1OA組,繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測定β淀粉樣蛋白和過磷酸化 TAU蛋白

采用SP法對THP-1源性巨噬細(xì)胞與洗滌濃縮血小板孵育(實(shí)驗(yàn)組)和不加血小板單獨(dú)孵育(對照組)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。蛋白陽性染色以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色為準(zhǔn)。選染色均勻的區(qū)域,在100倍視野下計(jì)數(shù)著色細(xì)胞占視野細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)(Perentage of positive cells,PP),共計(jì)數(shù)5個視野,取平均值,按著色細(xì)胞占視野細(xì)胞總數(shù)的百分比分別計(jì)1～4分：1分為＜30%,2分為30%～69%,3分為 70%～89%,4分為90%～100%。按細(xì)胞著色強(qiáng)弱(Staining intensity,SI)記0～3分：0分為不著色,1分為著色弱,2分為中等著色,3分為強(qiáng)著色。觀察者單盲記分,每張切片的積分為PP×SI值,每組取5張切片。

1.2.4 蛋白免疫印跡法檢測過磷酸化TAU蛋白和β淀粉樣蛋白的表達(dá)

收集細(xì)胞用蛋白免疫印跡法檢測過磷酸化TAU蛋白和β淀粉樣蛋白。以對照組為參照,用各組的面積灰度值與對照組相比,所得的相對值作統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1 mRNA的表達(dá)

收集各組細(xì)胞PBS洗滌離心兩次,Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。以細(xì)胞總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以GAPDH為內(nèi)對照,進(jìn)行半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)。ABCA1上游引物為5'-GCTGCTGAAGCCAGGGCATGGG-3',下游引物為 5'-GTGGGGCAGTGGCCA TACTCC-3',擴(kuò)增產(chǎn)物為 306bp;GAPDH上游引物為5'-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3',下游引物為5'-TGTCGCTGTTGA AGTCAGAG-3',擴(kuò)增產(chǎn)物為697bp。聚合酶鏈反應(yīng)條件：94℃溫育 5min后,94℃變性1min→58℃退火1min→72℃延伸1min,共32個循環(huán),最后一次循環(huán)72℃延伸10min;PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。用Labwork凝膠圖像分析系統(tǒng)收集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞激活的形態(tài)學(xué)變化

THP-1單核細(xì)胞懸浮生長,呈圓形,如圖1A。佛波酯刺激可激活、誘導(dǎo)THP-1向巨噬細(xì)胞分化,使細(xì)胞貼壁生長,且形態(tài)轉(zhuǎn)為梭形分枝狀,生出偽足等,如圖1B。

2.2 巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞過磷酸化TAU蛋白和β淀粉樣蛋白的生成

TAU蛋白的兩個重要磷酸化位點(diǎn) TAU231(蘇 aa)、TAU396(絲aa)在實(shí)驗(yàn)組與對照組均出現(xiàn)陽性染色,且實(shí)驗(yàn)組和對照組間無顯著性差異(P＞0.05),表明THP-1源性巨噬細(xì)胞及其泡沫細(xì)胞皆能生成一定量的過磷酸化TAU蛋白。但β淀粉樣蛋白在泡沫細(xì)胞內(nèi)的生成量明顯多于巨噬細(xì)胞(P＜0.05),見表 1、圖 2。

表1 過磷酸化TAU蛋白和β淀粉樣蛋白的生成(,n=5)

表1 過磷酸化TAU蛋白和β淀粉樣蛋白的生成(,n=5)

＊：與對照組相比P＜0.05

組別 Phospho-Tau(T231)Phospho-Tau(S396) β-amyloid(1-40)對照組(-PLT) 7.38±1.65 7.70±1.95 1.03±0.43實(shí)驗(yàn)組(+PLT) 7.56±1.23 7.68±1.35 4.36±1.27＊

2.3 蛋白磷酸酶抑制劑崗田酸對TAU蛋白的過磷酸化和β淀粉樣蛋白生成的影響

不同濃度OA處理THP-1源泡沫細(xì)胞24h后,Tau蛋白磷酸化修飾的免疫印跡結(jié)果見圖3、4。結(jié)果顯示Tau蛋白過磷酸化程度與OA量的增加呈大致的正相關(guān)量-效關(guān)系(P＜0.05),S396、T231兩位點(diǎn)上出現(xiàn)明顯過磷酸化。

不同濃度OA處理THP-1源泡沫細(xì)胞24h后β淀粉樣蛋白的生成結(jié)果見圖 5、圖6。

結(jié)果顯示,β淀粉樣蛋白的生成與OA量的增加亦呈大致的正相關(guān)量-效關(guān)系(P＜0.05)。

2.4 崗田酸對ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCA1 mRNA表達(dá)的影響

隨OA濃度增加,ABCA1mRNA表達(dá)呈劑量依賴的下降,恰與β淀粉樣蛋白的升高成反向相關(guān),見圖7、圖8。

3 討論

Alzheimer病的兩個標(biāo)志性損傷為老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié),前者主要系A(chǔ)β的沉積,而后者主要為過磷酸化Tau蛋白自身的異常聚集。Aβ在動脈粥樣硬化斑塊中的沉積已被證實(shí),并有實(shí)驗(yàn)證實(shí)Aβ的沉積促進(jìn)AS斑塊的形成[1],但過磷酸化Tau蛋白在AS發(fā)病中的作用尚甚少文獻(xiàn)報(bào)道。本文結(jié)果顯示,蛋白磷酸酶抑制劑崗田酸對Tau蛋白的過磷酸化和Aβ的生成產(chǎn)生平行的促進(jìn)作用,同時(shí)使膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCA1的表達(dá)反向下調(diào),提示過磷酸化Tau蛋白可能參與了AS的發(fā)病。

研究證實(shí),蛋白磷酸酶缺陷可導(dǎo)致Tau蛋白過磷酸化[7]。崗田酸(Okadaic acid,OA)是從Halichondria okadai提取的蛋白磷酸酶(Protein phosphatase,PP)PP-1和PP-2A的抑制劑,能使Tau蛋白絲、蘇氨酸殘基位點(diǎn)去磷酸化[8]。本研究選擇了比較具有代表性的Tau(S396),Tau(T231)兩個磷酸化位點(diǎn),結(jié)果表明OA抑制PP確可使 Tau蛋白兩個絲、蘇氨酸位點(diǎn)Tau(S396),Tau(T231)過磷酸化,并呈量-效關(guān)系。

Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白,與細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等多種功能有關(guān)。正常情況下Tau蛋白以磷酸化和去磷酸化兩種形式存在,兩者處于一種平衡狀態(tài)。過度磷酸化Tau蛋白生物學(xué)功能發(fā)生變化。Tau蛋白異常顯示與21三體型Down氏綜合征的發(fā)病有關(guān),而Down氏綜合征通常在40歲后即出現(xiàn)Alzheimer病,且出現(xiàn)淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein,APP)終身的持續(xù)高表達(dá)[9]。因此我們推測,OA誘導(dǎo)的Aβ增加可能繼發(fā)于過磷酸化Tau蛋白的增加。

AT P結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體 ABCA1是膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞的外排泵。ABCA1基因突變所引起的一種著名的遺傳性疾病被稱為Tangier病,由于膽固醇外排障礙,病人全身有廣泛的泡沫細(xì)胞形成,肝脾腫大,并有顯著早發(fā)的 AS和冠心病[10]。ABCA1表達(dá)下調(diào)與AS的發(fā)病相關(guān),β-淀粉樣蛋白已被顯示可干預(yù)膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)[11],但目前巳報(bào)導(dǎo)的機(jī)制是針對清道夫受體的[5],而本文所報(bào)導(dǎo)的針對ABCA1的表達(dá)下調(diào)則有可能是其另一機(jī)制,目前尚未見相關(guān)報(bào)導(dǎo)。

本文以THP-1巨噬細(xì)胞與洗滌濃縮血小板共孵育制備泡沫細(xì)胞的依據(jù)源于Daniel M.和Guido R.Y等的研究[1,12],他們發(fā)現(xiàn)Aβ和APP存在于血小板,巨噬細(xì)胞吞噬血小板和Aβ是動脈粥樣硬化中巨噬細(xì)胞活化的一種重要機(jī)制。本文以巨噬細(xì)胞與血小板共孵育后,Aβ亦明顯增多。正常時(shí)Aβ的生成和降解保持平衡,并有一些因素保持Aβ的可溶性。Aβ的過量生成和沉積已被證實(shí)不但是AD的重要發(fā)病機(jī)制,且參與了AS的發(fā)病。本研究中,OA誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞Tau蛋白過磷酸化伴隨著平行的Aβ增加和ABCA1的表達(dá)下調(diào),提示其在AS發(fā)病中也可能具有重要的作用。

綜上,本文探討了THP-1單核細(xì)胞誘導(dǎo)生成巨噬細(xì)胞并進(jìn)一步吞噬血小板生成泡沫細(xì)胞的過程及其相關(guān)發(fā)病因素,結(jié)果顯示,過磷酸化Tau蛋白和Aβ的增加可能都與膽固醇外排泵ABCA1的表達(dá)下調(diào)相關(guān),顯示過磷酸化Tau蛋白亦參與AS的發(fā)病。結(jié)合已有的文獻(xiàn)資料,我們推測：Tau蛋白過磷酸化→Aβ增加→ABCA1表達(dá)下調(diào)→膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)障礙→AS,可能是一條Tau蛋白參與AS的發(fā)病通路。

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