劉立濤 陳夏靜 匡文娟 譚顯曙 邵振俊 楊蔭 周黎明△

(1.四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理教研室,成都 610041;2.四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生理教研室,成都 610041)

頭孢菌素類抗生素是近年來發(fā)展極快的一種抗生素,因其抗菌譜廣、療效高、過敏反應(yīng)少、毒副作用小,作用安全、幾乎占領(lǐng)了國(guó)內(nèi)外的抗生素市場(chǎng)[1]。

頭孢克洛膠囊系第二代口服頭孢菌素,臨床主要用于上呼吸道感染、尿路感染等[2],其在泌尿系統(tǒng)能夠保持較高的血清藥物濃度[3]。Krepel等人把頭孢克肟與頭孢氨芐、頭孢克洛等口服抗生素的抗菌作用進(jìn)行了比較,頭孢克肟對(duì)大腸埃希菌的作用比頭孢克洛強(qiáng) 8-10倍[4]。

第一代頭孢菌素類抗菌譜廣,其對(duì)革蘭陽性菌包括耐藥金葡菌株作用強(qiáng)于第二代,目前臨床常用的二代頭孢菌素類口服劑頭孢克洛,對(duì)大腸埃希菌、克雷伯菌等有較強(qiáng)作用。第三代頭孢菌素目前廣泛應(yīng)用于臨床感染,對(duì)革蘭陽性菌尤其金黃色葡萄菌活性較第一代差[1]。

本實(shí)驗(yàn)要通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)對(duì)第一代頭孢菌素頭孢氨芐、第二代頭孢克洛與第三代頭孢克肟對(duì)臨床分離的金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌及大腸埃希菌的抗菌活性進(jìn)行比較,求證三代頭孢菌素的體內(nèi)體外的抗菌活性強(qiáng)弱。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

金黃色葡萄球菌(09-1),大腸埃希菌(09-1)與肺炎克雷伯菌(09-2)。以上菌株均為2008年6月至2009年10月在四川成都地區(qū)、北京地區(qū)和山東人民醫(yī)院及蘇州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院收集的臨床分離致病菌。在收集單位經(jīng)VITEK-60自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定再經(jīng)本室用 API20E、20NE、Staph系列及常規(guī)方法重新鑒定。每株細(xì)菌在實(shí)驗(yàn)前經(jīng)瓊脂平板劃單菌落分純,37℃隔夜新鮮培養(yǎng)的菌體適當(dāng)稀釋用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑

頭孢克肟片(哈爾濱凱程制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào)：091201);頭孢氨芐膠囊(石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司生產(chǎn),批號(hào)：0812103);頭孢克洛膠囊(華北制藥集團(tuán)制劑有限公司,批號(hào)：0903001)。羧甲基纖維素鈉(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心);牛肉膏(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司);蛋白胨(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司);瓊脂粉(JAPAN進(jìn)口分裝);氯化鈉(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司);可溶性淀粉(成都宏博實(shí)業(yè)有限公司);酪蛋白水解物(杭州微生物試劑有限公司)。

1.1.3 儀器

HWY-100C恒溫?fù)u床(上海智誠(chéng));隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(PYX-DHS-40×50,上海市躍進(jìn)農(nóng)場(chǎng)醫(yī)療器械廠)。

1.2 方法

1.2.1 體外抗菌試驗(yàn)

采用二倍肉湯稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度(MIC)：抗菌藥物貯存液濃度為1280 mg?L-1。具體操作方法：排列14只試管,其中第1管內(nèi)加肉湯1.6ml,其余各管加入M H肉湯1ml。吸取藥物原液0.4ml加入第1管,充分混勻后吸出1.0ml加入第2管依次至第13管,第13管棄去1.0ml,第14管為不含藥物的生長(zhǎng)對(duì)照。此時(shí)各管所含藥物分別為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06 mg? L-1。然后在每管內(nèi)加入制備好的菌懸液(106CFU?ml-1)1ml,充分混勻。此時(shí)第 1 管至第 13 管藥物濃度分別為 128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 mg? L-1。將所有試管置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-20 h后,觀察結(jié)果并記錄MIC。

1.2.2 體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)

1.2.2.1 試驗(yàn)藥品與試驗(yàn)菌株 試驗(yàn)藥品來源同上;試驗(yàn)菌株同上,來源同體外試驗(yàn)。

1.2.2.2 動(dòng)物 普通清潔級(jí)小鼠,雌雄各半,18-22 g,由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)：SCXK(川)-10-2006。在12小時(shí)光暗交替循環(huán)下自由飲食,雌雄分籠飼養(yǎng)。

1.2.2.3 菌液配制 將實(shí)驗(yàn)用菌于感染前1天,挑取2-3個(gè)單菌落接種于2ml MH肉湯,37℃培養(yǎng)6 h,取此菌液0.1ml轉(zhuǎn)種于10ml肉湯中,37℃培養(yǎng)18 h,該菌液即為原菌液。將該菌液用5%干酵母液進(jìn)行倍比稀釋備用(當(dāng)日新鮮配制)。

1.2.2.4 藥液配備 試驗(yàn)用藥均用0.5%CMC(羧甲基纖維素)將所需試驗(yàn)的藥物制備成顆粒均勻的混懸液(口服灌胃)。

1.2.2.5 最小致死菌量(Minimal lethal dose,MLD)試驗(yàn)

取健康昆明種小白鼠,體重 18～22 g,隨機(jī)分為4組,雌雄各半,吸取上述不同稀釋濃度菌液,分別腹腔注射入小鼠體內(nèi),每鼠0.5ml,感染后觀察14 d,并記錄小鼠死亡數(shù),以引起小鼠100%死亡的最低菌量作為最小致死菌量(MLD),用該菌量作為體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)的感染菌量。

1.2.2.6 半數(shù)有效量(ED50)測(cè)定

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中求出小鼠感染受試菌后,100%小鼠死亡與未出現(xiàn)死亡的藥物劑量濃度后,在該劑量范圍內(nèi)設(shè)5個(gè)劑量組,精確稱取藥物,按效價(jià)將其換算到藥物重量,用0.5%CM C將各受試藥物稀釋至所需濃度,制備成顆粒均勻的混懸液,劑量組間距為1∶0.6。

將小鼠試驗(yàn)前18 h禁食不禁水,隨機(jī)分為5組,雌雄各半,分別于腹腔感染試驗(yàn)菌液,每鼠0.5ml,感染后即刻按各自劑量(見表1)灌胃給藥0.5ml。4 h后重復(fù)給藥一次,觀察并記錄小鼠死亡數(shù),連續(xù)觀察14 d,根據(jù)小鼠死亡數(shù),計(jì)算半數(shù)有效量ED50。

表1 各種藥物的最大劑量

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 體外最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定結(jié)果

經(jīng)采用二倍肉湯稀釋法測(cè)定頭孢克肟、頭孢克洛、頭孢氨芐對(duì)體內(nèi)保護(hù)實(shí)驗(yàn)用于感染小鼠的金黃色葡萄球菌(09-1)、大腸埃希菌(09-1)和肺炎克雷伯菌(09-2)的最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定結(jié)果見表2。

2.2 最小致死菌量(MLD)測(cè)定結(jié)果

體內(nèi)保護(hù)實(shí)驗(yàn)用于感染小鼠的金黃色葡萄球菌(09-1)、大腸埃希菌(09-1)和肺炎克雷伯菌(09-2)的最小致死菌量(MLD)分別為 108、107、108CFU ?ml-1,見表 3。

2.3 體內(nèi)保護(hù)實(shí)驗(yàn)ED50結(jié)果

體內(nèi)保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：半數(shù)有效量(ED50)及95%可信限,見表2。

表2 三種藥品對(duì)小鼠腹腔感染不同細(xì)菌體內(nèi)抗菌活性

表3 體內(nèi)感染小鼠所試細(xì)菌的最小致死菌量(MLD)

3 討論

頭孢類抗生素與青霉素具有相同的β-內(nèi)酰胺環(huán),也是其發(fā)揮作用的主要部分,它的作用機(jī)制：①抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成而起殺菌作用,即抑制細(xì)胞壁粘肽的合成。②促進(jìn)細(xì)菌自發(fā)溶酶系統(tǒng),導(dǎo)致細(xì)菌自發(fā)溶解死亡[1]。但不同的藥物其作用強(qiáng)度不同,頭孢克肟作為第三代口服頭孢菌素,較第二代頭孢克洛相比具有下列優(yōu)點(diǎn)：①抗菌譜擴(kuò)大,抗菌活力增強(qiáng);②最小抑菌濃度低;③組織細(xì)胞內(nèi)藥物濃度高、殺菌力強(qiáng),覆蓋了呼吸道感染的大多數(shù)病原體,在呼吸道感染中占有重要地位;④口感好,不良反應(yīng)輕,易于耐受,依從性好。常用于敏感菌所致的咽炎、扁桃體炎、支氣管炎等的治療,并能取得較好的療效[6]。第三代頭孢菌素的杰出的抗菌活性是基于它們對(duì)靶酶具有很強(qiáng)的親和力,以及對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的高穩(wěn)定性。和頭孢克洛、頭孢氨芐相比,頭孢克肟對(duì)大腸埃希氏菌中頭孢菌素類抗生素的主要結(jié)合位點(diǎn)PBP3和β-內(nèi)酰胺類抗生素的殺菌位點(diǎn)PBP1具有更高的親和力[5]。

本文通過體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)(ED50)初步結(jié)果表明,頭孢克肟口服灌胃對(duì)所試金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌感染小鼠的體內(nèi)抗菌活性明顯強(qiáng)于頭孢氨芐,但和頭孢克洛基本相同,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。頭孢克肟對(duì)所試金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌體外抗菌活性明顯強(qiáng)于頭孢克洛及頭孢氨芐。

1 王淑云,秦洪偉,陳多利.頭孢類抗生素臨床上合理應(yīng)用[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥,2010,5(5)：139-139.

2 韓繼美,楊子妮,余彩明,等.頭孢克洛不良反應(yīng)[J].中國(guó)誤診學(xué)雜志,2007,7(28)：6947-6947.

3 王樹芳.頭孢克洛膠囊治療尿路感染臨床研究[J].醫(yī)藥論壇雜志,2004,25(10)：48-49.

4 哀海龍,李仙義,王敬國(guó),等.頭孢克肟的藥理與臨床應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,1994,14(3)：111-112.

5 朱紅.頭孢克肟的作用機(jī)制[J].國(guó)外醫(yī)藥抗生素分冊(cè),2001,22(4)：158-160.

6 湯景平.頭孢克肟顆粒治療小兒急性細(xì)菌性上呼吸道感染70例臨床分析[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2008,8(147)：77-78.