耿會(huì)珍 劉明巖 趙麗君 劉珍 劉燕翔 黃寧 王伯瑤 吳琦

(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院感染免疫研究室,四川 成都 610041)

吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶被激活后,細(xì)胞發(fā)生呼吸爆發(fā),產(chǎn)生大量活性氧(ROS),成為細(xì)胞殺滅微生物的重要成分。2000年以后,在非吞噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)了NADPH氧化酶的同源物家族,被命名為 NOX(NADPH oxidase)家族。人類(lèi) NOX家族共有 7 個(gè)成員,即 NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、Duox-1和Duox-2[1-3]。NOX家族廣泛表達(dá)于機(jī)體的組織器官,其生物學(xué)功能成為研究的熱點(diǎn)。雙功能氧化酶(Duox-1和Duox-2)最初在甲狀腺中發(fā)現(xiàn),它們除了具有NOX的C端結(jié)構(gòu)域外,還有一個(gè)N端過(guò)氧化物酶樣胞外域,故稱(chēng)為雙功能氧化酶。近年來(lái),呼吸道、胰腺、腮腺、前列腺及腸胃道上皮等部位陸續(xù)發(fā)現(xiàn)Duox基因表達(dá)。泌尿道上皮是否表達(dá)Duox目前未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方法,觀察膀胱上皮細(xì)胞中是否存在Duox表達(dá),并初步探討基因的表達(dá)調(diào)控因素。

1 材料與方法

1.1 材料 人膀胱上皮細(xì)胞株(T24)為本實(shí)驗(yàn)室保存,RPMI-1640為GIBCO產(chǎn)品,新生小牛血清購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司,佛波酯(PMA)購(gòu)自 sigma公司,細(xì)胞因子(TNF-α、IFN-γ)為 PeproTech公司產(chǎn)品,Trizol試劑購(gòu)自 Invitrogen公司,逆轉(zhuǎn)試劑盒購(gòu)自M BI公司,Taq mix DNA聚合酶,DL2000 DNA Marker為天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品,PCR引物由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及刺激 T24細(xì)胞采用含有10%新生小牛血清的1640培養(yǎng)基(無(wú)抗生素)常規(guī)培養(yǎng)和傳代。實(shí)驗(yàn)前在每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿(60×15mm)中接種30萬(wàn)個(gè)T24細(xì)胞,37℃5%CO2孵箱培養(yǎng) 24h。加入 PMA(濃度為5nM)或細(xì)胞因子(TNF-α 20 ng?ml-1+IFN-γ20 ng?ml-1),分別在刺激后的12、24h收集細(xì)胞抽提RNA。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)無(wú)刺激的空白對(duì)照組。

1.2.2 PCR引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank的序列,用Prime5.0軟件分別設(shè)計(jì) Duox-1(登錄號(hào) AF213465),Duox-2(登錄號(hào)AF267981),β-actin(登錄號(hào) BC016045)的引物。

表1 PCR引物序列

1.2.3 總RNA提取 按 Trizol試劑說(shuō)明操作。貼壁 T24細(xì)胞直接用Trizol試劑裂解,提取的總RNA用異丙醇沉淀,溶于經(jīng)過(guò)DEPC處理的水中,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其含量及純度。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 在0.5ml的Eppendorf管中加入 RNasin 0.5μ l,Oligo(dt)1μ l,總 RNA 1μ l,M gCl24μ l,10(buffer 緩沖液2μ l,逆轉(zhuǎn)錄酶1μ l,用DEPC處理過(guò)的水補(bǔ)足至總體積20μ l,混勻,42℃反應(yīng) 40min,95℃5min終止反應(yīng),冰浴冷卻5min,-70℃保存。

1.2.5 PCR 擴(kuò) 增 Taq-mix 酶 12.5μ l,cDNA2μ l,上 游引 物0.5μ l,下游引物 0.5μ l,加水補(bǔ)足總體積 25μ l。Duox 反應(yīng)程序：94℃ 10min,94℃ 45s,53℃ 45s,72℃ 1min,40個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min,4℃保存。β-actin反應(yīng)程序：94℃3min,94℃30s,62℃30s,72℃1min,27個(gè)循環(huán),72℃5min,4℃保存。

1.2.6 PCR產(chǎn)物的鑒定 取 5μ lPCR產(chǎn)物,加 1μ l 6×lodding buffer,以1×TAE電泳緩沖液,在2%瓊脂糖凝膠上電泳約60min,Bio-Rad凝膠圖像分析儀拍照,Quantity One分析軟件對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性條帶進(jìn)行灰度掃描,以β-actin產(chǎn)物作校正分析,計(jì)算目的基因與內(nèi)參照β-actin灰度比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS軟件13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的鑒定

實(shí)驗(yàn)提取的細(xì)胞總RNA用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280比值在1.79-1.90之間,表明所提RNA的純度較高,蛋白質(zhì)和DNA污染少。從凝膠電泳上可以清晰看到28sRNA和18sRNA兩條帶(圖1),其亮度之比約為2∶1,5sRNA帶不明顯,表明RNA沒(méi)有降解。

2.2 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示Duox-1,Duox-2在T24細(xì)胞中有組成性表達(dá)(Constructive expression)。佛波酯(PMA)刺激后,Duox-1基因表達(dá)無(wú)明顯改變,而Duox-2基因表達(dá)增加,并以細(xì)胞刺激后12h表達(dá)量最高,與未刺激對(duì)照細(xì)胞相比增加4.5倍(P＜0.05)(圖2)。

聯(lián)合使用細(xì)胞因子 TNF-α和INF-γ,Duox-1基因表達(dá)無(wú)明顯變化,Duox-2基因表達(dá)顯著增高,以實(shí)驗(yàn)24h表達(dá)增加最為明顯,與未刺激對(duì)照細(xì)胞相比增加26.8(P＜0.05)(圖3)。

3 討論

圖3細(xì)胞因子(TNF-α、INF-γ)對(duì)T24細(xì)胞Duox1、Duox2基因表達(dá)的影響

吞噬細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞)殺菌機(jī)理研究揭示,通過(guò)細(xì)胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量超氧陰離子和活性氧(ROS),是吞噬細(xì)胞重要的殺菌方式。NADPH氧化酶(NADPH oxidase)是吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)的關(guān)鍵酶,該酶在吞噬細(xì)胞特異表達(dá)?；蛲蛔兌筃ADPH氧化酶活性喪失的病人很容易感染細(xì)菌和真菌,這種疾病稱(chēng)為慢性肉芽腫病(Chronic granulomatous disease,CGD)。2000年以來(lái),通過(guò)基因同源檢索,發(fā)現(xiàn)人的基因組中另外還有6個(gè)基因編碼的蛋白分子與NADPH氧化酶結(jié)構(gòu)和活性相似,因此具有NADPH氧化酶活性的分子被重新分類(lèi),分別稱(chēng)為NOX1-5(NOX是NADPH oxidase的簡(jiǎn)稱(chēng))以及Duox-1和Duox-2。在吞噬細(xì)胞特異表達(dá)的NADPH氧化酶現(xiàn)在稱(chēng)為NOX2,而其他NOX分子廣泛表達(dá)于機(jī)體的上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞[4-6]。

活性氧(ROS)參與了許多重要生命活動(dòng),比如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、免疫防御、組織損傷等,因此細(xì)胞(特別是非吞噬細(xì)胞)產(chǎn)生活性氧的分子基礎(chǔ)受人關(guān)注。雙功能氧化酶(Duox-1、Duox-2)是 NADPH氧化酶(NOX)家族的兩個(gè)重要成員,最早發(fā)現(xiàn)它們?cè)诩谞钕僦懈弑磉_(dá),研究表明Duox2基因突變將使甲狀腺激素合成減少,而Duox-1在甲狀腺中表達(dá)的生物學(xué)意義尚有待明確。近年來(lái)研究顯示Duox-1、Duox-2在呼吸道、腸道上皮細(xì)胞也有很高的表達(dá),并把它們與這些粘膜部位的免疫防御功能相聯(lián)系,氣管上皮細(xì)胞Duox-2產(chǎn)生的過(guò)氧化氫在乳過(guò)氧化物酶及硫氰酸鹽存在的情況下生成具有抗菌活性的次硫氰酸鹽,可能是呼吸道上皮的一種抗菌機(jī)制[7-8]。

雙功能氧化酶(Duox-1、Duox-2)是否在泌尿道粘膜上皮表達(dá)目前未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò) RT-PCR檢測(cè)表明在膀胱上皮細(xì)胞 T24中 Duox-1、Duox-2有組成性表達(dá),并且佛波酯(PM A)以及炎癥細(xì)胞因子(TNF-α和IFN-γ)作用均能刺激細(xì)胞Duox-2的表達(dá),但兩種刺激因素并不能改變Duox-1的表達(dá),這與呼吸道上皮細(xì)胞雙功能氧化酶表達(dá)調(diào)控研究比較相似,Duox-2表達(dá)受 IFN-γ刺激,而Duox-1表達(dá)受 IL-4和 IL-13刺激[9]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了膀胱上皮細(xì)胞表達(dá)雙功能氧化酶,因此它們?cè)诿谀虻勒衬さ纳飳W(xué)功能值得研究。而炎癥刺激增加Duox-2基因表達(dá),提示雙功能氧化酶可能參與膀胱粘膜免疫防御過(guò)程,為膀胱粘膜抗感染機(jī)制研究提供了新的線索。

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