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基于SPR生物傳感器的抗生素殘留檢測及影響因素分析

2010-05-10 09:31:32張婉潔張增福徐可欣
關鍵詞:氨芐折射率青霉素

石 婷,劉 瑾,張婉潔,蘇 洋,張增福,徐可欣

(天津大學精密測試技術及儀器國家重點實驗室,天津 300072)

抗生素是一種殺菌、消毒和抗炎癥的藥物,廣泛應用于許多疾病的治療.若抗生素殘留在牛奶中,長期食用就會導致人體對抗生素的免疫,對健康不利,也可能引起對抗生素過敏的人產(chǎn)生過敏反應.目前鮮奶中抗生素殘留的檢測方法大致分為 3類[1-2]:生物測定法(微生物測定法和放射受體測定法等)、理化分析法(波譜法和色譜及聯(lián)用技術等)、免疫法(放射免疫法、熒光免疫法和酶聯(lián)免疫法等).但這些方法都有各自的缺點,如耗時長、檢測程序復雜、費用高等.微生物受阻法則必須經(jīng)過幾小時甚至數(shù)十小時的培養(yǎng)過程才能觀察到結果;色譜檢測法操作過程雖然簡便,但前處理耗時耗力;微生物檢測法則需要培養(yǎng)細菌,制備培養(yǎng)基和抗生素標準殘留奶樣,準備過程比較復雜;酶聯(lián)免疫法檢測精度高,但是其耗材為一次性的,且成本很高.因此,牛奶中抗生素殘留的檢測領域一直受制于檢測技術的發(fā)展,不能實現(xiàn)真正的強制性檢測,在與發(fā)達國家的貿(mào)易中也屢遭禁止.

筆者主要研究和發(fā)展一種新型的基于表面等離子體的光學生物傳感技術,用于抗生素殘留快速檢出.該檢測法較上述幾種方法有明顯的優(yōu)點:①檢測時間短,20,min即可分析1個樣品;②操作簡便;③表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)檢測法敏感性高,準確度高.青霉素 G的檢測限為1~2,μg/kg,其他青霉素類藥物的檢測限也低于歐盟規(guī)定的標準[3],低于色譜檢測限 3~5 μg/kg和微生物受阻檢測法的檢測限[4].

2001年 Gaudin V等[5]首次開展了利用 SPR生物傳感器和免疫測定原理進行牛奶中的氯霉素和青霉素的檢測研究.2002年瑞典大學農(nóng)學院的Gustavsson等[6-7]也報道了利用SPR方法檢測牛奶中的β-內(nèi)酰胺類抗生素含量,并且對青霉素 G的檢測極限達到了 1~2,μg/kg,遠低于歐盟對青霉素 G 的最低檢出量(maximum residue limit,MRL)(4,μg/kg)的要求.但是他們采用的是DD-carboxypeptidase酶與 β-內(nèi)酰胺類抗生素的相互作用以及 β-內(nèi)酰胺類抗生素與其相應抗體的相互作用,該方法首先需要DD-carboxypeptidase酶與 3-羧胺酸在 47,℃下進行 5,min的孵化形成結合物后才能使用,在檢測過程中一般保持37,℃,且用到的試劑也比較多:penicillin G抗體、3-羧胺酸、3-羧胺酸抗體或者 2-羧胺酸抗體,至少需要 2種抗體,且為間接檢測,通過檢測 3-羧胺酸或者 2-羧胺酸間接獲得penicillin G的含量.因此,該方法測試環(huán)節(jié)比較繁瑣,外界條件要求高,不適于應用場合.德國的 Wuppertal大學的食品化學系[8],研究了采用青霉素綁定蛋白2x*(penicillium-binding protein 2x*,PBP 2x*)進行抗生素的測量.他們利用了 digoxigeninlabelled ampicillin(DIG-AMPI)與 PBP 2x*之間的綁定作用,這種方法是非特異性的綁定,采用涂抹 PBP 2x*的SPR傳感器,除了可以檢測到DIG-AMPI 外,還檢測到了脫脂牛奶中的 benzylpenicillin、ampicillin、amoxicillin、cloxacillin、cephalexin 和 cefoperazone.現(xiàn)階段,所有這些研究小組都是采用了BIAcore儀器.

綜上所述,利用 SPR生物傳感器進行抗生素殘留的免疫測定方法已經(jīng)得到了很好的實驗驗證,檢測精度相對其他抗生素檢測方法是非常高的,但同時也存在以下不足:①檢測方法繁瑣,有待于改進和發(fā)展,需要發(fā)展一種相對適用性較強、可推廣的檢測方法;②國外這些研究機構均采用 Pharmacia公司生產(chǎn)的BIAcore儀器,但 BIAcore儀器的價格非常高,采用現(xiàn)成的CM5芯片,成本太高不利于此項技術的推廣,筆者采用 SPR傳感器進行系統(tǒng)集成,以求突破受制于BIAcore儀器的現(xiàn)狀;③現(xiàn)有的研究成果大多是研究可以檢測到哪種抗生素,以及可以達到的檢測極限精度,對實驗條件、影響抗原抗體的特異性反應的各種因素的討論相對較少,研究不夠全面和深入.因此,發(fā)展一種流程簡單、檢測效率高、成本低的檢測方法是將 SPR檢測技術向抗生素殘留檢測領域的應用推進的必然趨勢.

筆者提出了一種基于抗原抗體相互作用原理的SPR檢測抗生素的新方法,該方法檢測流程相對簡單,對 SPR傳感器預處理后,可以進行反復多次測量,且傳感器的制備成本非常低,利于該方法的推廣和應用.為此研究了基于 SPR傳感器金膜的分子固定技術,將用于檢測的抗生素抗體固定到金膜表面,制成對某種抗生素有特異性吸附作用的生物傳感器,擺脫了對BIAcore公司的芯片的制約,實現(xiàn)了傳感器的自制備.通過抗生素與相應抗體之間的相互作用原理,實現(xiàn)了抗生素的直接測量.并針對獸藥中常用的氨芐青霉素進行了實驗研究,采用氨芐青霉素單克隆抗體固定到傳感器金膜表面,獲得該傳感器的工作曲線及最低檢出限.最后,探討了實驗條件對測量方法的影響,考察流速、溫度、pH 值及離子濃度對測量的影響,以期獲得最佳的測量條件,對該方法的使用和推廣具有很好的指導意義.

1 實驗原理

1.1 表面等離子體共振技術用于生物分子相互作用分析

SPR是電磁波所激勵的在金屬和電介質交界面上形成的影響電磁波傳播的諧振波,是一種光學現(xiàn)象,一種消逝波.表面等離子體共振技術是 19世紀70年代開始逐漸發(fā)展起來的一項新型的測量測試技術.利用 SPR制成的生物傳感器進一步利用了生物分子相互作用分析(bio-molecular interaction analysis,BIA)這一原理.BIA 現(xiàn)象的本質是,產(chǎn)生表面等離子共振現(xiàn)象時的光入射角稱為 SPR角,SPR角隨金膜表面折射率的變化而變化,而折射率的變化又與金膜表面結合的分子質量成正比.SPR 生物傳感器正是基于 BIA這一原理,將探針或配體固定于傳感器芯片鍍著的金膜表面,含分析物的液體流過傳感片表面,分子間發(fā)生特異性結合時可引起傳感片表面折射率改變,通過檢測 SPR信號改變而監(jiān)測分子間的相互作用.在分子作用過程中,靶物質可以天然狀態(tài)存在于分析物中,在自然條件下進行分析,因此保證了所得結果的真實性.因此,該技術具有實時、免標記、無需事先純化地定量檢測生物分子和監(jiān)測兩種或多種分子間的結合的優(yōu)點.

1.2 傳感器表面的分子自組裝分子層的建立

采用免疫技術對傳感器進行化學處理,將其制作成對抗生素有特異性吸附作用的生物傳感器,將抗體固定在傳感器表面.目前抗體在傳感器表面的固定方法主要包括:氨基偶聯(lián)法、巰基偶聯(lián)法、醛基偶聯(lián)法、組氨酸-鎳螯合法及親和吸附法等.在實驗中采用常用的方法,即氨基偶聯(lián)法,其原理為羧甲基化葡聚糖表面羧基與蛋白質的氨基通過化學交聯(lián)反應,將抗體通過形成共價鍵的形式固定在金膜表面.具體流程如圖1所示,在金膜表面形成BSA蛋白質層;再通過 EDC/NHS的混合液活化羧化的 BSA蛋白質層,形成有活性的 NHS酯蛋白層;抗體通過與活化的NHS酯蛋白層發(fā)生反應,通過氨基形成共價鍵連接;最后用乙醇胺封閉沒有反應的活化NHS酯蛋白層.該化學處理過程中金膜表面的微觀分子變化如圖2所示.

圖1 傳感器表面分子自組裝分子層的建立流程Fig.1 Establishment of molecular self-assembly molecular film on sensor surface

圖2 傳感器金膜表面結構示意Fig.2 Schematic diagram of gold film sensor surface

2 實驗與結果

2.1 儀器裝置與試劑

2.1.1 儀器裝置

采用的實驗系統(tǒng)如圖 3所示.微量注射泵(Kd Scientific Inc.)能夠自動控制注射器來恒速注射液體,Spreeta表面等離子體共振測量系統(tǒng)(TI 美國德州儀器公司)用來監(jiān)測流過傳感器金膜表面的液體折射率的變化[9],六通道選擇閥(Upchurch公司)可以進行不同試劑間的選擇切換,根據(jù)需要向傳感器選擇注入不同試劑.

圖3 表面等離子體共振測量實驗裝置示意Fig.3 Schematic diagram of SPR measurement equipment

2.1.2 試劑

磷酸鹽緩沖液(PBS),10,mmol/L,pH7.4;牛血清白蛋白(BSA),美國 Amresco 公司生產(chǎn);1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCL),上海延長生化有限公司生產(chǎn);N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)上海延長生化有限公司生產(chǎn);丁二酸酐(succinic anhydride),美國 Amresco 公司生產(chǎn);二甲亞砜(DMSO),美國 Amresco 公司生產(chǎn);大鼠單克隆抗氨芐青霉素抗體(mouse mono-clonal antibody antiampicillin,McAb),美國 USBiological 公司生產(chǎn);乙醇胺(ethanolamine hydrochloride),美國 Sigma-Aldrich公司生產(chǎn);氨芐青霉素(ampicillin),生物分子級,德國SERVA公司生產(chǎn).實驗中用到所有的試劑均為分析純,水為去離子水.

2.2 SPR生物傳感器的制備

預處理過程:在金膜表面修飾一層用 EDC/NHS活化的 BSA,混合溶液中各溶液的體積比為 VBSA∶VEDC∶VNHS=5∶2∶2(室溫下保持 15,min),形成均勻的交叉連接的蛋白層;再利用磷酸二氫鈉鹽和DMSO配置的丁二琥珀酸酐溶液(pH為 6.5)浸泡蛋白質層(室溫下保持 12,h),使蛋白質層羧化,成為金膜和抗體的連接紐帶.

抗體的固定過程:調(diào)節(jié)液體流速為 10,μL/min,向傳感器內(nèi)通入 PBS溶液,待基線穩(wěn)定后通入 EDC/NHS(體積比為 1∶1)5~10,min,活化羧化的 BSA 蛋白質層,形成有活性的 NHS酯蛋白層,通入 PBS緩沖液沖洗,待基線穩(wěn)定后再通入McAb10,min,McAb通過與活化的蛋白層發(fā)生反應,通過氨基形成共價鍵連接,為了封住未反應的活化羧基官能團,通入1,mol/L乙醇胺溶液,封閉沒有反應的活化NHS酯蛋白層.

圖 4顯示了抗氨芐青霉素抗體在傳感器金膜表面固定時折射率的變化,通入抗體前后的折射率變化為 2,224×10-6,說明抗體已固定在金膜表面,折射率變化為 1,相當于 1,pg/mm2的量[10],以此計算表面抗體的覆蓋量為2.2,ng/mm2.

圖4 單克隆抗氨芐青霉素抗體固定時典型的折射率的變化Fig.4 Typical binding refractive index of antiampicillin McAb

2.3 抗生素水溶液測量實驗

實驗過程中,測量基線去離子水的折射率標準差約為15×10-6,因此傳感器金膜表面的響應,即所測溶液的折射率變化值應大于3倍的基線標準差 45×10-6,才能作為可信測量值.

首先配置含氨芐青霉素質量濃度為 2,000,ng/mL的水樣品待用,再分別取一定量的所配樣品并將其按比例分別稀釋為 1.25,ng/mL、2.5,ng/mL、5,ng/mL 的水樣品待測.測量時(流速 10,μL/min)先通入純水樣品,穩(wěn)定后通入一種質量濃度的氨芐青霉素水樣品,測量結果為兩種樣品折射率的差值,再通入氫氧化鈉進行表面重建(流速為 20,μL/min),以便進行下次測量.每種質量濃度的測量都重復上述過程.

圖 5是 3種質量濃度氨芐青霉素水溶液通入傳感器后的折射率的變化曲線,而表1是通入前后的折射率差值.從圖 5中可以看出,不同質量濃度的氨芐青霉素水樣品達到動態(tài)平衡后有很好的區(qū)分(每次測量的純水的折射率都修正到 1.333 000),并且隨著濃度的增大,折射率也增大,存在正比關系.1.25,ng/mL的折射率差值為 80×10-6左右,大于 45×10-6,認為是可信測量,因此,該方法的檢出限低于1.25,ng/mL.該方法的檢出限遠遠低于歐盟規(guī)定的最大殘留限量(4,μg/kg)[3],也是其他方法不能比擬的.

圖5 不同質量濃度的氨芐青霉素水溶液的折射率比較Fig.5 Comparison of different concentrations of ampicillin Fig.5 solution

表1 通入氨芐青霉素水溶液后的折射率Tab.1 Refractive index at different ampicillin solution

圖 6建立的是不同質量濃度的氨芐青霉素水樣折射率的模型曲線.整體工作曲線呈單調(diào)上升,且在低質量濃度段,線性關系較好;而到了高質量濃度段,曲線上升減弱.測量未知樣品時,先測量未知濃度樣品與純水的折射率差值,帶入到工作曲線中對應的橫坐標即為待測樣品的質量濃度.

圖6 氨芐青霉素水溶液折射率模型曲線Fig.6 Refractive index model curve of ampicillin solution

3 測量條件的影響研究

3.1 進樣流速對氨芐青霉素在抗體表面吸附的影響

在表面等離子體共振測量控制系統(tǒng)中,氨芐青霉素在大鼠單克隆抗體表面吸附過程(宏觀動力學過程)包括兩個連續(xù)的步驟,即本體溶液中的氨芐青霉素傳輸?shù)絺鞲衅砻?傳質過程)及其與芯片表面大鼠單克隆抗體的吸附作用(本征吸附動力學)過程[11],即

式中:Abulk表示本體溶液中的被吸附物質(氨芐青霉素);Asurface表示到達傳感片表面的氨芐青霉素;B表示固定在傳感片表面的大鼠單克隆抗體;AB表示吸附于大鼠單克隆抗體的被吸附物質(氨芐青霉素);Lm表示質量傳輸系數(shù);ka、kb表示動力學常數(shù)[12].SPR的折射率表示傳感片表面吸附AB的量.在低流速階段,被吸附物的傳質速度慢于吸附作用的速度,即式(1)慢于式(2)時,吸附過程受傳質過程控制,折射率的變化速率是由式(1)中的 Lm決定的.一般而言,對特定的被吸附物質而言,其本征吸附動力學常數(shù)是一定的,增大流速會加快傳質速度,吸附過程經(jīng)歷由傳質過程控制→傳質速率與本征吸附動力學控制→本征動力學控制的過程.當樣品流速過大時,傳質速度快于本征吸附動力學速度,吸附過程由本征吸附動力學控制,折射率的變化速率是由式(2)中的平衡常數(shù)ka/kb決定.

對 5,ng/mL氨芐青霉素水溶液在 5個不同流速下的折射率進行了比較,結果見圖 7.流速與折射率差值的關系見圖8.

圖7 不同流速下5 ng/mL氨芐青霉素水溶液折射率的比較Fig.7 Comparision of refractive index with 5 ng/mL ampicillin solution at different flow velocities

圖8 流速與折射率差值的關系曲線Fig.8 Relatlion curve of different flow velocities and refracttive index

圖8中的曲線反映了抗體過剩時,流動的氨芐青霉素溶液(抗原)與大鼠單克隆抗體結合反應變化規(guī)律.由于反應后的抗原抗體復合物會附著到棱鏡金膜表面,因此,折射率的變化將能反映出復合物量的變化.當流速很低時,吸附過程主要受傳質過程控制,形成的抗原抗體復合物較少,折射率差值變化較小.隨著流速的不斷提高,抗原分子數(shù)不斷增加,形成的抗原抗體復合物也隨之增多,折射率差值增大.當流速為 10,μL/min時,折射率差值達到了極值.流速繼續(xù)增大時,由結合和解離系數(shù)控制,折射率差值又逐漸變?。?/p>

3.2 溫度對氨芐青霉素在抗體表面吸附的影響

抗體抗原反應,受溫度的影響較大.在一定范圍內(nèi),溫度升高可促進分子運動,使抗原抗體分子碰撞機會增多,二者的結合反應加速.但溫度過高(56,℃以上),可導致抗原抗體變性或遭破壞,補體被滅活,已形成的免疫復合物亦將發(fā)生解離.一般實驗常在37,℃恒溫條件下進行.

圖9為5,ng/mL氨芐青霉素水溶液在3個不同溫度下的折射率結果.從圖 9中可看出,37,℃時折射率最大,25,℃和 50,℃時的折射率都小于 37,℃時的,說明 37,℃是本實驗的最適宜溫度,折射率達到最大.

3.3 pH值的影響

氨芐青霉素在大鼠單克隆抗體表面的靜電吸附量的大小受氨芐青霉素和大鼠單克隆抗體的電荷類型及二者表面電荷密度的影響,兩者帶相反的靜電荷有利于靜電吸附的發(fā)生.氨芐青霉素帶有正電荷有利于氨芐青霉素在抗體表面的靜電吸附.當氨芐青霉素溶液 pH 大于其等電點 pI 時,氨芐青霉素表面帶有凈的負電荷;pH 小于其等電點 pI 時,氨芐青霉素表面帶有凈的正電荷.傳感片表面的大鼠單克隆抗體在pH 值大于3.0 左右時帶負電荷,當pH 值小于3.0左右時帶正電荷[13-14].因此,當pH > pI 時,氨芐青霉素與大鼠單克隆抗體均帶負電荷,不利于兩者的靜電吸附;當3.0 〈pH 〈 pI 時,氨芐青霉素帶正電荷,抗體帶負電荷,有利于兩者的靜電吸附,并且吸附量隨著兩者電荷密度的增強而增加;當pH 〈 3.0 時,氨芐青霉素與大鼠單克隆抗體均帶正電荷,同樣不利于兩者的靜電吸附.另外在低 pH 環(huán)境下,蛋白質容易產(chǎn)生變性,失去其天然構象,所以偶聯(lián)蛋白的 pH值不應低于3.0,并高于蛋白質變性失活的pH.

3.4 離子濃度的影響

抗原與抗體特異結合后,親水膠體變?yōu)樵魉z體.如有適當濃度的電解質存在,可中和其表面電荷,使電勢降低,促進二者相互凝聚出現(xiàn)可見的沉淀或凝集現(xiàn)象.若無電解質存在,則不易出現(xiàn)可見反應.但如電解質的濃度過高,則會引起蛋白質非特異性沉淀.此種作用稱為鹽析,常用于抗體的提純.在實驗中為了不使抗原與抗體特異結合后出現(xiàn)沉淀或凝集現(xiàn)象,用去離子水作為抗原和抗體的稀釋劑.

4 結 論

(1)詳細考察了利用 SPR生物光學傳感器測量牛奶中抗生素的可行性,利用了特異性的氨芐青霉素抗體對金膜表面進行修飾,折射率大大提高,成功地測量了不同質量濃度的氨芐青霉素水溶液折射率,能夠分辨最低質量濃度為 1.25,ng/mL的樣品;同時根據(jù)不同質量濃度樣品的折射率不同建立了模型曲線.

(2)當流速很低時,吸附過程主要受傳質過程控制,流速增大折射率增大,當增大到一定程度后主要受本征動力學過程控制,即結合和解離系數(shù)的控制,流速增大折射率減小;通過實驗可知,10,μL/min是一個最佳流速,同種質量濃度的樣品此時折射率最大.

(3)溫度對氨芐青霉素與抗體的結合也有很大的影響,溫度過高可能會使抗原抗體失活,溫度過低分子運動不積極結合程度不高. 根據(jù)理論與實驗研究得出,在 37,℃恒溫條件下,分子碰撞機會最多,折射率最大,所以選擇此溫度為實驗時溫度.

(4)pH值的選擇要根據(jù)抗原抗體的等電點不同,使抗原抗體帶相反的電荷,這樣有利于二者的結合,實驗中 pH值選擇 7.0左右,反應在中性環(huán)境下進行時不會影響抗原抗體的理化性質,并且結合程度最大.

(5)實驗中所需溶液全部用去離子水配置以消除離子對抗原抗體反應的影響,且不會出現(xiàn)沉淀或凝集現(xiàn)象.

本文的研究為牛奶中抗生素殘留檢測奠定了良好的基礎.在牛奶中對氨芐青霉素殘留實現(xiàn)成功檢測后,還可將此檢測方法推廣到其他抗生素,為探索適合我國的抗生素測量方法提供了可靠的依據(jù),具有廣泛的市場前景.

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