李 昕 周 靜 楊昌英

(1.三峽大學化學與生命科學學院,湖北 宜昌 443002;2.三峽旅游職業(yè)技術學院,湖北 宜昌 443002)

生物傳感器是一種分析檢測裝置,它將某種生物材料、生物衍生材料或仿生材料緊密連接或結合到生化轉換器或轉換微系統(tǒng)上[1].各種類型的生物傳感器相應問世,并被應用于醫(yī)學、食品安全、畜牧獸醫(yī)、環(huán)境監(jiān)測、發(fā)酵工程、軍事和科學研究等諸多領域[2-3],生物傳感器具有高靈敏度、高選擇性、分析快捷、操作簡單和儀器可集成化、微型化的特點,應用前景非常廣闊,極具研究開發(fā)意義.

細胞色素C幾乎存在于所有的原核生物和真核生物之中,作為細胞凋亡的信息物質,在研究病理學、藥理學以及線粒體變化的過程中具有非常重要的作用.細胞色素C作為一種重要的生物電子載體,在生物體內可以發(fā)生可逆的氧化還原反應,但卻不能在金屬電極上直接進行可逆的電化學反應[4].細胞色素C的這種電化學反應被稱之為直接電化學.繼此之后,細胞色素C的電化學反應得到更加深入的研究[5].已有報道用細胞色素C作為敏感元件監(jiān)測細胞培養(yǎng)的膠質母細胞瘤中超氧化物的產量[6].對苯二胺(p-Phenylenediamine,簡稱PPD),也是一種有廣泛應用的中間體,主要用于聚合物制品、紡織品和染發(fā)劑行業(yè),也可用于制取橡膠防老劑和照片顯影劑,另外對苯二胺還是常用的檢驗鐵和銅的靈敏試劑[7].在電化學領域中,PPD可以作為單體在不同條件下通過化學或電化學方法聚合為導電聚合物或非導電聚合物[8].本文通過自組裝法和吸附法兩種不同方法制備了修飾電極,運用循環(huán)伏安和交流阻抗,探究了細胞色素C修飾電極檢測過氧化氫和亞硝酸鈉以及對苯二胺電化學和酶催化反應產物引起的的電極鈍化.

1 實驗材料

1.1 實驗試劑

谷氨酸(北京奧博星生物技術有限責任公司),EDC(上海共價有限公司),其它試劑均為國產分析純,1mol?L-1H2SO4溶液,PBS(pH=7.0)緩沖溶液,0.02mol?L-1L-谷氨酸,Fe電解液(5.0mmol?L-1K3Fe(CN)6+5.0 mmol?L-1K4Fe(CN)6+0.1 mmol?L-1KCl)溶液:依次稱取 1.6460 g K3Fe(CN)6,2.1142g K4Fe(CN)6,7.4587g KCl溶解在200mL的水中,然后定容至1000 mL.

1.2 主要儀器

AUTOLAB-PGSTAT12電化學工作站(荷蘭),SZ-93自動雙重純水蒸餾器(上海),KQ-100型超聲波清洗器(昆山),DHG-9076A型電熱恒溫鼓風干照箱(上海).

1.3 修飾電極的制備

1.3.1 自組裝法修飾電極

裸電極處理:將玻碳電極在拋光布上拋光成鏡面,在硫酸∶過氧化氫(7∶3)的混合液中煮沸5min,最后在超聲波水浴中用二次石英重蒸水徹底清洗.

電極活化:在經過電極預處理后還需要用電化學方法進行電極活化.取25 mL燒杯,加入15mL 1 mol?L-1H2SO4溶液,在室溫下,采用電化學工作站,用循環(huán)伏安法活化,掃描電位區(qū)間為0～+1.5V,掃描速度為50mV/s,掃描圈數(shù)為20圈.

谷氨酸修飾電極:谷氨酸通過電化學方法在電極上聚合.在25mL燒杯中加入15 mL谷氨酸溶液,在室溫下,采用電化學工作站,掃描電位區(qū)間為-0.8V～+1.8V,掃描速度為100 mV/s,掃描圈數(shù)為10圈.通過電化學聚合,電極表面上形成一層聚L-谷氨酸薄膜,即制成PGLA-GCE電極.

細胞色素C修飾電極:細胞色素C自組裝法修飾電極是采用靜電結合法,谷氨酸上的羧基與細胞色素C上的氨基通過靜電吸引結合,以使細胞色素C附于電極表面.

在1.5mL離心管,用移液槍加入100μ L細胞色素C 溶液和200μ L和PBS,在4℃下,放置12h.通過此步驟,電極表面上形成一層聚L-谷氨酸和細胞色素C組合的薄膜,即制成CYTC-PLGA-GCE電極.

1.3.2 吸附法修飾電極

裸電極預處理步驟與自組裝法修飾電極一樣.細胞色素C吸附法修飾電極是利用殼聚糖把細胞色素C固定于電極表面.用氮氣將經過預處理的玻碳電極表面吹干,用移液槍取一定量 0.5%殼聚糖與1mmol?mL-1細胞色素C混合溶液滴于電極表面,于空氣中倒置電極4h以上.在電極表面滴加Nifion溶液形成一層Nifion膜,放置5h后將電極置于PBS溶液中2h.

1.3.3 電化學測試

電化學測試在電化學工作站上進行.分別以修飾電極(裸電極)為工作電極,Pt電極為對電極,甘汞電極為參比電極,選擇合適電解液(主要為Fe(CN)63-/4-與KCl混合溶液和PBS),進行電化學檢測.

(1)循環(huán)伏安掃描.取25 mL燒杯,加入15 mL Fe(CN)63-/4-與KCl混合溶液作為電解液,組裝電解池,掃描范圍-0.2～0.6V,掃描速度100mV/s.

(2)PBS中信號響應.取25mL燒杯,加入15mL PBS,組裝電解池,選擇合適的掃描范圍(本實驗中發(fā)現(xiàn)-1.2～0.4V這一范圍效果較好)和掃描速度進行循環(huán)伏安掃描.修飾完電極之后需要采用不同掃速進行掃描 ,一般為 20、50、100、150、200、250、300 和350mV/s.

1.3.4 細胞色素C修飾電極的催化性能

(1)自組裝法修飾電極的催化性能.細胞色素C修飾電極對過氧化氫的響應:取25 mL燒杯,加入15 mL PBS(pH=7.4),以細胞色素C修飾電極為工作電極組裝電解池,逐步加入一定量過氧化氫,每加入一次之后進行循環(huán)伏安掃描.掃描范圍為-1.2～0.4 V,掃描速度200mV/s.在同樣條件下對有聚合谷氨酸的電極進行對照試驗.

細胞色素C修飾電極對亞硝酸鈉的響應:取25 mL燒杯,加入15mL PBS(pH=5),以細胞色素C修飾電極為工作電極組裝電解池,逐步加入一定量亞硝酸鈉,每加入一次之后進行循環(huán)伏安掃描.掃描范圍為-1.2～0.4V,掃描速度200 mV/s.在同樣條件下對有聚合谷氨酸的電極進行對照試驗.

(2)吸附法修飾電極的催化性能.細胞色素C修飾電極在PBS中的響應:取25mL燒杯,加入15 mL PBS(pH=7.4).以細胞色素C修飾電極為工作電極組裝電解池,進行循環(huán)伏安掃描.掃描范圍為-1.0～0.4V,掃描速度100mV/s.

細胞色素C修飾電極在含對苯二胺電解質溶液中的鈍化:取25 mL燒杯,加入 15 mL PBS(pH=7.4)和150ul PPDA.以細胞色素C修飾電極為工作電極組裝電解池,進行循環(huán)伏安掃描.掃描范圍為-0.6～0.5V,掃描速度 100 mV/s,掃描30圈.在同樣條件下對裸電極進行對照試驗.

2 結果分析

2.1 自組裝法修飾電極

2.1.1 裸GCE電極的信號表征

圖1為玻碳電極在5 mM Fe(CN)63-/4-和0.1 MKCl混合溶液構成的電解質溶液中的循環(huán)伏安譜.掃描速度100mV/s,在0.236V和0.150V處出現(xiàn)一對可逆的氧化還原峰,峰電位差ΔEp=86mV.在理想狀態(tài)下,裸電極的峰電位差為59mV,在實驗條件下應盡可能接近此值.實驗中要求此值小于90mV,才可使用電極,否則要重新處理電極,直到符合要求為止.圖2為玻碳電極在濃度為0.02mol?L-1磷酸緩沖溶液中的循環(huán)伏安.圖中沒有明顯氧化還原峰,此圖形用于與細胞色素C修飾電極所得循環(huán)伏安圖做比對.

圖1 玻碳電極的循環(huán)伏安譜

圖2 玻碳電極磷酸緩沖溶液中的循環(huán)伏安

2.1.2 谷氨酸在電極表面的聚合

通過電化學聚合法所得循環(huán)伏安如圖3所示,圖形為聚合過程掃描10圈的組合圖.由圖可知隨著聚合的進行,-0.12V處峰值逐漸增大,表明谷氨酸在電極上逐漸聚合.實驗過程中發(fā)現(xiàn)谷氨酸的濃度對聚合效果有很大影響.當谷氨酸濃度過小時,有聚合谷氨酸的電極在PBS中進行響應得不到明顯的氧化還原峰,說明聚合于電極表面的谷氨酸的量較小,聚合效果較差.此時應該加大谷氨酸的量,選擇一個合適的濃度值.

圖3 電化學聚合法所得循環(huán)伏安圖

有聚合谷氨酸的電極在PBS中循環(huán)伏安響應,如圖4所示.由圖可知在-0.35V和-0.05V處出現(xiàn)一對明顯的可逆氧化還原峰.有聚合谷氨酸的電極和裸玻碳電極在含F(xiàn)e電解質液中的循環(huán)伏安圖,如圖5所示.由圖可知,有聚合谷氨酸的電極相較裸玻碳電極氧化還原峰電流略微降低.

圖4 聚合谷氨酸的電極在PBS中循環(huán)伏安響應

圖5 聚合谷氨酸的電極和裸玻碳電極的電化學性能

2.1.3 細胞色素C修飾電極

(1)細胞色素C修飾電極的信號表征

圖6中各曲線代表一定掃速時細胞色素C修飾電極在PBS中循環(huán)伏安響應圖.圖中顯示,在-0.4 V和0.05V處出現(xiàn)一對明顯的可逆氧化還原峰.這對氧化還原峰為電極表面細胞色素C活性中心的氧化還原峰.圖7為裸玻碳電極、有聚合谷氨酸的電極和細胞色素C修飾電極在含F(xiàn)e電解質液中的循環(huán)伏安比對圖.圖中顯示細胞色素C修飾電極相較聚合有谷氨酸的電極氧化還原峰電流進一步降低,這說明細胞色素C已經修飾于電極之上,且經過細胞色素C修飾電極,電極表面阻抗進一步增大.

圖6 細胞色素C修飾電極在PBS中循環(huán)伏安響應

(2)細胞色素C修飾電極的催化性能

圖7 修飾電極在含F(xiàn)e電解質液中的循環(huán)伏安

圖8 細胞色素C修飾電極對過氧化氫的響應

①修飾電極對過氧化氫的響應.細胞色素C修飾電極對過氧化氫的響應見圖8.圖中顯示氧化峰消失,在-0.4V處出現(xiàn)一還原峰,且在一定的范圍內,隨著加入過氧化氫的量不斷增加,還原峰增大.當加入過氧化氫濃度增大到一定程度時還原峰減小.圖9為有聚合谷氨酸的電極對過氧化氫的響應圖.圖中顯示氧化峰消失,在-0.35V處出現(xiàn)一明顯還原峰,且在一定范圍內,隨著加入過氧化氫的量不斷增加,還原峰增大.當加入過氧化氫濃度增大到一定程度時還原峰減小.表明在一定范圍內,有聚合谷氨酸的電極可以用于檢測過氧化氫,而且效果比較明顯.比較有聚合谷氨酸的電極和細胞色素C修飾電極對過氧化氫的響應圖可知,谷氨酸修飾電極對過氧化氫的反應要明顯一些.因此若要檢測過氧化氫,可直接使用谷氨酸修飾電極,實驗方案更為簡單,且價格相對低廉.

圖9 有聚合谷氨酸的電極對過氧化氫的響應

②修飾電極對亞硝酸鈉的響應.在酸性條件下,亞硝酸鈉發(fā)生歧化反應生成NO.在圖10中,隨著亞硝酸鈉的加入,細胞色素C修飾電極對亞硝酸鈉的循環(huán)伏安響應圖還原峰逐漸增加.由圖可知,加入亞硝酸鈉后,亞硝酸鈉在溶液中反應生成一氧化氮,使得氧化還原電流增加.

圖10 細胞色素C修飾電極對亞硝酸鈉的循環(huán)伏安響應(左圖為局部放大)

有聚合谷氨酸的電極在PBS中對不斷加入亞硝酸鈉響應圖(圖11)譜沒有發(fā)生明顯變化,說明有聚合谷氨酸的電極對一氧化氮沒有明顯反應.對照試驗表明細胞色素C修飾電極對亞硝酸鈉的響應是由于細胞色素C的催化作用.

圖11 聚合谷氨酸的電極在PBS(pH=5)中對不斷加入亞硝酸鈉響應圖譜

(3)吸附法修飾電極

①細胞色素C修飾電極在PBS中的響應.用自組裝法修飾電極在PBS中的響應所得循環(huán)伏安圖在-0.4處出現(xiàn)一明顯峰.此處用吸附法修飾電極,相應循環(huán)伏安圖在相同位置出現(xiàn)一對氧化還原峰,而且出峰效果相對較好.但圖形整體對稱性不明顯,不同的電極修飾方法所表現(xiàn)出的電化學性質存在著一定的差別.

圖12 細胞色素C修飾電極在PBS中的響應

②細胞色素C修飾電極在含對苯二胺電解質溶液中的鈍化.裸玻碳電極在含對苯二胺的電解質溶液的循環(huán)伏安見圖13(a),隨著圈數(shù)的不斷增加,氧化還原峰逐漸減小,最后消失.在溶液中,對苯二胺氧化態(tài)物質與還原態(tài)物質相結合,在電極表面形成一層膜,阻礙電子傳遞,使得氧化還原峰逐漸減小.細胞色素C具有一定的電化學催化活性,圖13(b)經細胞色素C修飾的電極在相同條件下沒有出現(xiàn)電極鈍化現(xiàn)象,在掃了30圈之后氧化還原峰沒有明顯減小.細胞色素C作為一種蛋白酶,能使對苯二胺處于氧化狀態(tài),從而防止電極表面膜的形成,避免電極鈍化的發(fā)生.由圖可觀察到在-0.4V出現(xiàn)一還原峰,但隨著圈數(shù)的增加,峰值逐漸減小并消失.這可能是電極表面結構發(fā)生了一定的變化,使得細胞色素C活性中心被覆蓋,從而其相應的電化學反應受到抑制.相關文獻在探討酶催化作用對修飾電極在含對苯二胺電解質溶液中鈍化情況時指出,所得循環(huán)伏安圖顯示一對新的氧化還原峰.這對氧化還原峰的存在是由于溶液中形成了可溶性的對苯二胺低聚物.

圖13 裸玻碳電極(a)和細胞色素 C修飾電極(b)在對苯二胺的電解質溶液的循環(huán)伏安

(4)影響修飾電極鈍化的因素

圖14中每一條曲線表示一種對苯二胺濃度下細胞色素C修飾電極循環(huán)伏安圖.由圖可知對苯二胺濃度越大,氧化還原值越大.這說明溶液中電極反應形成的物質有助于電子傳遞.

圖14 PPDA濃度對修飾電極鈍化的影響

3 結 論

(1)聚合谷氨酸的電極對過氧化氫具有一定的響應,所得循環(huán)伏安圖在-0.35V顯示一個還原峰,且在一定的范圍內,隨著加入過氧化氫的量不斷增加,還原峰增大.在一定范圍內,有聚合谷氨酸的電極可以用于檢測過氧化氫,而且效果比較明顯.聚合谷氨酸的電極對一氧化氮沒有明顯反應.

(2)細胞色素C修飾電極對過氧化氫響應與有聚合谷氨酸的電極對過氧化氫的反應相似.與細胞色素C修飾電極相比聚合谷氨酸的電極對過氧化氫的反應要明顯.可直接使用谷氨酸修飾電極測過氧化氫,實驗方案更為簡單,且價格相對低廉.細胞色素C修飾電極對亞硝酸鈉有反應.隨著亞硝酸鈉的加入,細胞色素C修飾電極對亞硝酸鈉的循環(huán)伏安響應圖還原峰逐漸增加.

(3)裸電極在含有中發(fā)生鈍化,細胞色素C修飾電極可以避免對苯二胺電解質溶液對電極的鈍化.在濃度一定的對苯二胺溶液中,隨著掃速增大,電極鈍化速度減慢.在不同濃度的對苯二胺溶液中進行試驗,發(fā)現(xiàn)對苯二胺濃度越大,電極鈍化速度越快.

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