張 亮,杜曉寧,李良君,李 杰

(上?；ぱ芯吭荷虾７€(wěn)定同位素工程技術(shù)研究中心,上海 200062)

穩(wěn)定性同位素15N示蹤技術(shù),在研究多肽和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測序與合成、氨基酸和蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的代謝機理、藥物動力學(xué)機理等方面有著不可替代的作用[1]。其中,15N標(biāo)記L-亮氨酸作為示蹤劑,已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物、化工等行業(yè)[2]。發(fā)酵法制備L-亮氨酸的技術(shù)已經(jīng)比較成熟。Tsuchida等[3]采用亞硝基胍(NTG)誘變等方法處理乳糖發(fā)酵短桿菌2256,最終選出一株L-亮氨酸高產(chǎn)菌(34號菌,Ile-+2-TAr+β-HLr),可在13%葡萄糖培養(yǎng)基中積累L-亮氨酸達34 g/L。張素鑫等[4]選育出鈍齒棒桿菌 L-421可產(chǎn)L-亮氨酸達20 g/L。但是,現(xiàn)有發(fā)酵技術(shù)由于其含有豐富的天然有機氮源營養(yǎng),不適用于生產(chǎn)高豐度的15N標(biāo)記L-亮氨酸,因此,需要對菌種進行馴化,并研究特殊培養(yǎng)技術(shù),使其適應(yīng)于低有機氮源營養(yǎng)環(huán)境并能高水平產(chǎn)酸,從而提高15N同位素的利用率,保證產(chǎn)品的高品質(zhì)。本研究擬探索適用于15N標(biāo)記L-亮氨酸生產(chǎn)的實驗配方、發(fā)酵工藝、提純工藝,以制備高品質(zhì)15N標(biāo)記L-亮氨酸,提高其經(jīng)濟效益。

1 主要實驗材料

1.1 主要儀器

SCS-24型巡回式自動搖瓶機:上海市離心機械研究所;LRH-250A型生化培養(yǎng)箱:廣東省醫(yī)療器械廠;LS-B50L型高壓蒸汽滅菌鍋 :上海醫(yī)用核子儀器廠;756MC型紫外-可見分光光度計:上海精密科學(xué)儀器有限公司;SBA40C型生物傳感儀:山東省科學(xué)院生物研究所;ALPHA1-2 LD型凍干機:德國CHRIST公司;同位素質(zhì)譜計:美國 Thermos公司。

1.2 主要試劑

15N-硫酸銨、15N-尿素:上海化工研究院生產(chǎn);732H+型陽離子交換樹脂:上海樹脂廠提供;AS1.542誘變株:中國科學(xué)院微生物研究所提供。

2 實驗方法

2.1 菌種馴化與保存

以AS1.542誘變株為出發(fā)菌,馴化培養(yǎng)得到黃色短桿菌 TLU53-8,帶有5種遺傳標(biāo)記:Met-、Ile-、SGr、а-ABr、β-HLr,凍干保存。

2.2 培養(yǎng)基配方

活化斜面培養(yǎng)基:葡萄糖 1 g/L,蛋白胨10 g/L,牛肉膏 10 g/L,酵母膏 5 g/L,NaCl 2.5 g/L,瓊脂條20 g/L,p H7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖5 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏 10 g/L、NaCl 2.5 g/L、p H 7.0～7.2。

最佳發(fā)酵培養(yǎng)基(針對豐度實驗):葡萄糖100 g/L、15N-尿素 2 g/L、15N-硫酸銨 20 g/L、K2HPO42 g/L 、MgSO40.5 g/L 、FeSO40.02 g/L、MnSO40.02 g/L、生物素 0.000 3 g/L、VB10.000 3 g/L、蛋白胨1 g/L、高豐度菌體水解液10 g/L 、p H7.0～7.2。

2.3 搖瓶發(fā)酵工藝

斜面活化培養(yǎng):將黃色短桿菌 TLU53-8置恒溫培養(yǎng)箱中,30℃恒溫培養(yǎng)20～24 h。

斜面二次活化培養(yǎng):取一環(huán)培養(yǎng)20～24 h的TLU53-8菌轉(zhuǎn)接到活化斜面培養(yǎng)基。

種子液培養(yǎng):取一環(huán)活化后的 TLU53-8菌體接入裝有25 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,九層紗布封口,30℃下置于巡回式搖瓶柜,200 r/min培養(yǎng)15 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):用移液槍取3 mL上述培養(yǎng)好的種子液接入裝有20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,九層紗布封口,28℃下置于巡回式搖瓶柜,220 r/min開始培養(yǎng),中間檢測殘?zhí)?殘?zhí)?1%時,停止發(fā)酵反應(yīng),一般需78～90 h。

2.4 提取方法

采用離子交換法分離產(chǎn)品[5]。發(fā)酵液經(jīng)除菌和除蛋白預(yù)處理,用草酸調(diào)p H至3～4,過732氫型樹脂柱,水洗至中性,分別用0.05、0.10和0.20 mol/L的氯化銨進行梯度洗脫,去除發(fā)酵液中的雜酸;將收集到的亮氨酸單斑溶液濃縮,再次過732氫型樹脂柱,水洗至中性后,用氨水洗脫。氨水洗脫液經(jīng)濃縮、趕氨、活性炭脫色后,無水乙醇結(jié)晶過夜;將晶體濾出,烘干,可得純白色晶體。通過氯化銨、氨水兩步洗脫法進行提純,總提取收率達80%。得到的15N標(biāo)記L-亮氨酸純度>99%,15N豐度>98%。

Fmax代表了群體當(dāng)中的最大適應(yīng)度值，F(xiàn)avg代表了群體當(dāng)中的平均適應(yīng)度值。由上式可知，群體最大適應(yīng)度和平均適應(yīng)度差值越大，Pc和Pm的值相應(yīng)會越小，而K1和K2在這個過程代表著自適應(yīng)調(diào)節(jié)力度的大小。通過自適應(yīng)參數(shù)算法的引入，在遺傳過程根據(jù)實際情況及時調(diào)整Pm和Pc，遺傳算法將具有更好的靈活性，收斂速度提高，并且陷入局部最優(yōu)解的可能性降低。

2.5 分析方法

發(fā)酵液產(chǎn)酸測定:采用氨基酸自動分析儀。

菌體光密度測定:菌體稀釋 20倍,采用756MC分光光度計在620 nm處測定光密度。

葡萄糖測定:采用SBA-40A型葡萄糖-谷氨酸分析儀測定。

L-亮氨酸純度測定:采用凱氏定氮法測定。15N豐度測定:采用同位素質(zhì)譜測定。

p H的測定:采用6.4～8.0精密試紙測定。

3 結(jié)果與討論

3.1 溫度對發(fā)酵的影響

發(fā)酵前期菌體的生長對溫度敏感,發(fā)酵中后期溫度對菌體產(chǎn)酸影響較大。由種子培養(yǎng)溫度實驗可知,TLU53-8菌株的最佳生長溫度為28 ℃。因此 ,發(fā)酵實驗選取 24、26、28、30、32、34 ℃進行,結(jié)果示于圖1。由圖1可知,在28～30℃時,吸光度較高,表明菌體生長好,菌體濃度大,L-亮氨酸產(chǎn)量較高,28℃發(fā)酵產(chǎn)酸達到實驗最大值23.53 g/L。溫度太低菌體生長緩慢,難以完成對原料的轉(zhuǎn)化;溫度太高,菌體易衰老、后勁不足,不利于產(chǎn)酸。基于以上考慮,L-亮氨酸發(fā)酵溫度控制在28℃為宜,最高不宜超過30℃。

圖1 溫度對L-亮氨酸發(fā)酵的影響▲——L-亮氨酸;○——糖酸轉(zhuǎn)化率;◆——吸光度

3.2 p H對發(fā)酵的影響

對搖瓶分批發(fā)酵而言,欲控制全發(fā)酵過程始終維持某一恒定的p H十分困難。添加一定量的碳酸鈣可以使p H不致于劇烈下降,以防止發(fā)酵液酸度過大。培養(yǎng)基的組成和配制時初始p H不同,在滅菌過程中p H降低的程度也不同。因此,在接種前用滅菌的5 mol/L NaOH溶液重調(diào)p H,并在發(fā)酵過程每隔4 h調(diào)p H至所需值 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,誤差范圍 ±0.1,并在所調(diào)的各p H處測定糖酸轉(zhuǎn)化率和亮氨酸產(chǎn)量。實驗在同一搖床上進行,發(fā)酵72 h結(jié)束,結(jié)果示于圖2。由圖2得知,發(fā)酵過程控制p H 7.0有利于菌體生長和發(fā)酵產(chǎn)酸。p H對發(fā)酵前期的菌體生長和中后期發(fā)酵產(chǎn)酸影響較大。p H 7.0時菌體生長較快,發(fā)酵結(jié)束時,L-亮氨酸產(chǎn)量可達18.65 g/L。p H過低或過高,菌體生長緩慢,培養(yǎng)基p H長時間偏高或偏低,會使代謝途徑上的酶偏離最適酶活力狀態(tài),導(dǎo)致菌體生長不佳,代謝產(chǎn)酸減少。

3.3 優(yōu)化條件與初始條件的搖瓶分批發(fā)酵比較

綜合考慮培養(yǎng)基組成、裝液量、種齡和接種量等因素對TLU53-8菌株發(fā)酵產(chǎn)酸的影響。對發(fā)酵條件進行優(yōu)化,優(yōu)化前后的參數(shù)列于表1。采用表1中所列優(yōu)化條件與初始條件,分別同時進行5瓶平行的分批發(fā)酵實驗。取樣分析L-亮氨酸產(chǎn)量、殘?zhí)橇?殘?zhí)橇拷抵良s5 g/L即結(jié)束發(fā)酵。測殘液量,計算L-亮氨酸得率、糖酸轉(zhuǎn)化率,結(jié)果列于表2。由表2可知,優(yōu)化條件與初始條件相比較,L-亮氨酸產(chǎn)量、L-亮氨酸產(chǎn)率、糖酸轉(zhuǎn)化率分別提高了19.25%、27.81%、28.00%。

圖2 p H對L-亮氨酸發(fā)酵的影響▲——L-亮氨酸產(chǎn)量;○——糖酸轉(zhuǎn)化率;◆——吸光度

表1 L-亮氨酸搖瓶分批發(fā)酵條件(n=5)

表2 優(yōu)化條件與初始條件的搖瓶分批發(fā)酵實驗結(jié)果比較

3.4 菌體水解液添加量的確定

通過低豐度實驗可知:采取常規(guī)發(fā)酵中添加玉米漿的方法很難做到既保證豐度不被稀釋,又能保證產(chǎn)酸水平。主要原因是玉米漿中含有的大量有機氮物質(zhì)(天然豐度)會通過細胞代謝,稀釋終產(chǎn)品豐度。因此實驗中采取用高豐度菌體水解液代替玉米漿的方法來解決以上問題。實驗結(jié)果顯示,在保證產(chǎn)品產(chǎn)酸量的條件下,終產(chǎn)品豐度稀釋很少,完全能符合產(chǎn)品要求。

高豐度菌體水解液的制備:離心收集高豐度發(fā)酵產(chǎn)生的菌泥,用3 mol/L的硫酸對菌泥進行酸水解40 h,得到高豐度的菌體水解液。經(jīng)過質(zhì)譜分析,此菌體水解液15N豐度為97.6%。通過多次發(fā)酵實驗,此菌體水解液能代替發(fā)酵過程所使用的玉米漿,且終產(chǎn)品豐度幾乎不稀釋。在相同的發(fā)酵培養(yǎng)基下(其中原料15N-硫酸銨同位素豐度99.9%,原料15N-尿素同位素豐度99.9%),對高豐度菌體水解液添加量做梯度實驗,分析不同高豐度菌體水解液添加量對發(fā)酵產(chǎn)酸、產(chǎn)品15N豐度的影響,結(jié)果示于圖3。由圖3可知,添加自制高豐度菌體水解液,可以有效防止產(chǎn)品豐度的稀釋,尤其是添加10 g/L菌體水解液對菌體產(chǎn)酸及豐度最佳。

3.5 生物素含量確定

為進一步減輕培養(yǎng)基中有機氮營養(yǎng)源對15N豐度的影響,所用的種子和發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨含量相對較低,為保證菌體生長良好,可通過添加高生物素實現(xiàn)強制發(fā)酵。

發(fā)酵使用篩選培養(yǎng)基配方為:菌體水解液10 g/L、VB1200μg/L,改變生物素含量做梯度實驗,其它配方同2.2節(jié)中的發(fā)酵培養(yǎng)基,結(jié)果示于圖4。由圖4可知,添加高生物素對生長有明顯的促進作用,控制1 000μg/L對產(chǎn)酸最為有利。

圖3 菌體水解液添加量對發(fā)酵產(chǎn)酸、產(chǎn)品豐度影響□——產(chǎn)酸量(g·L-1);■——產(chǎn)品豐度(%)

圖4 生物素含量對發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響

3.6 15 N原料及15 N副產(chǎn)物的回收

發(fā)酵過程完畢后,發(fā)酵液中含有大量未反應(yīng)完的15N無機鹽、15N-雜酸以及15N菌泥。根據(jù)工藝特性將回收分為兩個階段:發(fā)酵階段回收及分離提取階段回收。

發(fā)酵階段主要回收15N菌泥。向菌泥中加入NaOH,在200℃下水解2 h,待菌泥中15N有機物變?yōu)?5N-氨氣時,用硫酸吸收,最后變?yōu)?5N-硫酸銨。分離提取階段主要回收15N無機鹽、15N-雜酸。離子交換法分離氨基酸過程中會產(chǎn)生帶有15N無機鹽、15N-雜酸的水洗液和洗脫液,將其合并起來,減壓濃縮,再加入NaOH,于200℃下水解,用硫酸吸收。計算15N回收率。由于15N原料價格昂貴,因此需要將未反應(yīng)的15N原料及15N副產(chǎn)物進行回收,結(jié)果列于表3。由表3可見,用此工藝制備15N-L-亮氨酸,15N回收率約為76%,可大大節(jié)約15N原料成本。

3.7 同位素15 N豐度實驗

3.7.1 低豐度實驗

考察針對TLU53-8菌種的發(fā)酵配方和發(fā)酵工藝對15N標(biāo)記L-亮氨酸的生產(chǎn)實用性,需要進一步進行低豐度15N實驗,驗證豐度下降規(guī)律和產(chǎn)酸水平。將TLU53-8菌株從斜面接種于種子培養(yǎng)液中,28℃搖床培養(yǎng)24 h,之后接入發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶,裝量25 mL),30℃、220 r/min于巡回式搖床上培養(yǎng)約72 h,直到發(fā)酵終止,計算平均產(chǎn)酸量。將上述發(fā)酵液合并處理,提取得到15N標(biāo)記 L-亮氨酸白色晶體,分析提取收率。采用同位素質(zhì)譜計分析原料15N-硫酸銨同位素豐度,原料15N-尿素同位素豐度,產(chǎn)品15N標(biāo)記L-亮氨酸豐度;采用高效液相色譜分析產(chǎn)品純度。

結(jié)果表明,發(fā)酵平均產(chǎn)酸為22 g/L。15N-L-亮氨酸提取收率為70.49%。經(jīng)質(zhì)譜分析:原料15N-硫酸銨同位素豐度為10.22%,原料15N-尿素同位素豐度為10.26%,產(chǎn)品15N-L-亮氨酸豐度為9.82%,產(chǎn)品純度經(jīng)高效液相色譜分析為99.7%。

表3 15 N回收率實驗結(jié)果

3.7.2 高豐度實驗

所用實驗條件和處理方法與低豐度實驗相同。

結(jié)果顯示,15N標(biāo)記 L-亮氨酸提取收率為68.22%。經(jīng)質(zhì)譜分析:原料15N-硫酸銨同位素豐度99.9%,原料15N-尿素同位素豐度99.9%,產(chǎn)品15N標(biāo)記L-亮氨酸豐度98.41%,產(chǎn)品純度經(jīng)高效液相色譜分析為99.70%。此結(jié)果表明:黃色短桿菌 TLU53-8在最佳工藝條件下,可發(fā)酵得到高品質(zhì)15N-L-亮氨酸。

4 結(jié) 語

本研究以選育獲得的突變株黃色短桿菌TLU53-8(帶有 5 種遺傳標(biāo)記:Met-、Ile-、SGr、а-ABr、β-HLr)出發(fā) ,研究了適用于15N 標(biāo)記 L-亮氨酸生產(chǎn)的實驗配方、發(fā)酵工藝以及提取工藝,通過低豐度和高豐度實驗進一步確認選育的TLU53-8菌株可應(yīng)用于15N標(biāo)記L-亮氨酸的生產(chǎn),發(fā)酵產(chǎn)酸>18 g/L,產(chǎn)品15N豐度>98%,純度>99%。優(yōu)化后的工藝適用于制備高品質(zhì)15N標(biāo)記L-亮氨酸。在不受氮源限制的普通發(fā)酵過程中,此菌株產(chǎn)酸能達25 g/L。

采取用高豐度菌體水解液代替玉米漿的方法能解決豐度稀釋問題,且能夠保證產(chǎn)酸水平>18 g/L。此法具有通用性,其他同位素標(biāo)記氨基酸的生產(chǎn)也可借鑒此法。

對發(fā)酵及分離提取過程中產(chǎn)生的未反應(yīng)完的15N原料及15N副產(chǎn)物的回收,可大幅節(jié)約15N原料成本。

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