吳海燕 ，李明義 ，，范根成 ，王述柏 ，單 虎 ，劉拂曉

（1.青島農(nóng)業(yè)大學，山東 青島 266109；2.青島易邦生物工程有限公司，山東 青島 266032）

禽流感病毒屬正黏病毒科，是分節(jié)段、單股負鏈RNA病毒。病毒基因組共編碼十種蛋白，其中血凝素蛋白（HA）是病毒最重要的保護性抗原，可誘導產(chǎn)生中和抗體。AIV存在廣泛的抗原漂移和抗原轉變現(xiàn)象，抗原性變異是流感病毒最顯著的特點之一，其中HA基因突變頻率最高，因此對HA基因的研究是對流感病毒抗原性和遺傳性研究的重點。

世界禽流感的防制經(jīng)驗表明，疫苗免疫是預防和控制H9亞型禽流感暴發(fā)的有效措施和主動性戰(zhàn)略。但是因H9亞型禽流感直接引發(fā)的死亡率相對較低，在我國未能引起足夠的重視，造成其未能得到控制而廣泛傳播、流行。雖然低致病性禽流感直接致死率較低，但若與其他病原微生物如大腸桿菌發(fā)生混合感染，則能顯著提高病毒的致病力，給養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴重危害。本實驗室自1998到2007年這十年間，分離得到了我國不同地區(qū)、不同宿主來源的H9N2禽流感病毒，應用逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）擴增HA基因，獲得33株H9N2亞型禽流感病毒的核苷酸序列。結合GenBank中公開發(fā)表的其他國內(nèi)H9亞型禽流感HA基因序列共65株，應用DNAstar軟件進行分析，繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹，從分子角度對近些年來H9N2禽流感病毒在我國的流行規(guī)律進行總結和分析。

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1 材料方法

1.1 病毒

H9N2亞型禽流感病毒分離株由本實驗室與中國動物衛(wèi)生與流行病學中心合作，從我國湖南、湖北、山東、云南、廣西、安徽、遼寧、福建、山東、河南、浙江等地分離所得（表1）。

1.2 RT-PCR鑒定及序列比對分析

應用DNAStar軟件，參照Gen-Bank中H9N2亞型禽流感病毒血凝素（HA）基因序列，設計引物擴增HA基因，引物序列如下：P1：5'-ATGGAAACA GTATCACTAAT-3'；P2：5'-TATATACAAATG TTGCATC-3'。

PCR擴增程序：94.5℃預變性2min；94.5℃30s，55℃40s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃延伸9min。將擴增得到的HA基因送交大連寶生物公司進行序列測定。根據(jù)序列測定結果，與GenBank中發(fā)表的H9N2亞型禽流感序列進行同源性比對。

2 結果與分析

我們對33個分離病毒進行RT-PCR檢測，擴增產(chǎn)物的電泳結果與預期相符，進一步驗證了所分離毒株為H9N2亞型禽流感病毒。結合Gen-Bank中公開發(fā)表的其他國內(nèi)H9亞型禽流感HA基因序列共65株，應用DNAstar軟件進行分析，繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹，進行H9亞型禽流感病毒譜系全景分析（圖1）。

通過比較發(fā)現(xiàn)，同一時間、區(qū)域毒株并不只集結在一個系列當中，而是零星地散布于不同的系列不同的分支當中，如山東省2007年、2008年所分離到的10株毒株，通過核苷酸序列同源性的比對，它們相互之間的核苷酸同源性在88.9%～99.7%，最大差異值為10.8%，顯示出在同一時間，同一地區(qū)所分離毒株的同源性差異較大。將遼寧2007年分離株與云南2006年、2007年分離株的核苷酸同源性比較發(fā)現(xiàn)，最大差異值為13.2%，最低同源性為86.8%。分離自我國華東地區(qū)各省份，如安徽的4株H9亞型禽流感毒株 ck/ah/D16/07，ck/ah/AK13/08，ck/ah/AL16/08，ck/ah/CXD/08，相互之間的核苷酸同源性在92.2%～96.4%，顯示出在同一時間，同一地區(qū)所分離毒株的同源性差異較大；將廣東2003年分離株ck/gd/11/03與廣東2007年分離株ck/gd/02/07以及廣東2008年分離株ck/gd/GZ02/08相比較，同源性在91.8%～95.0%之間，且分布在不同的系列，這一結果又顯示同一地區(qū)的分離株，隨著時間的推移，毒株之間的同源性也發(fā)生著一定的變化。

總結HA基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析的結果，發(fā)現(xiàn)有以下特點：

2.1 H9N2亞型禽流感在較廣的區(qū)域內(nèi)流行存在

從圖1可以看到所劃分的基因進化樹大致可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三個系列，這三個系列分支間病毒同源性很低，三個系列覆蓋了我國遼寧、安徽、山東、廣東、福建、江蘇、河南、湖南、湖北、上海、廣西、云南、四川、新疆等絕大部分地區(qū)。

2.2 三個系列分支覆蓋的毒株范圍廣泛，沒有明顯的地域分布差異

從基因進化樹可見，Ⅰ系列分支中 ，ck/zj/ZC28/07，ck/zj/ZG1/07，ck/fj/11/07，ck/fj/08/07，ck/sd/mh-D2/07，ck/sd/D11/07，ck/ah/D16/07等毒株的地域來源廣泛，分布于山東、浙江、安徽等省市，病毒來源廣泛，沒有明顯的地域差異。第Ⅱ系列分 支包含 ck/sd/lx08，ck/sd/lx06/07，ck/sh/1/98，ck/hb/C1/07，ck/nj/13/03，ck/gx/H1/06，ck/gx/B1/06，ck/sh/16/01等來自山東、上海、南京、廣西等地。第Ⅲ系列分支也是同樣的情況。

2.3 同一系列分支包含的毒株時間跨度大，沒有明顯的時間分布規(guī)律

從基因進化樹可見，同一系列分支中包含的分離毒株來自不同的年代，各系列分支與禽流感毒株的分離時間沒有相關性。如，山東年分離株ck/sd/mh-D2/07，ck/sd/lx06/07，ck/sd/lx929/07，ck/sd/lx503/07，ck/sd/bs1210/07，上海 1998、2001年分離株 ck/sh/1/98，ck/sh/16/01，安徽2007、2008年分離株 ck/ah/D16/07，ck/ah/AK13/08，ck/ah/AL16/08，ck/ah/CXD/08，福建 2007、2008年分離株 ck/fj/11/07，ck/fj/08/07，南京2003年分離株ck/nj/13/03，散布在分別獨立的第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ系列的各級分支中。不同時間的流行毒株可能分屬于不同的系列分支。

2.4 毒株流行背景復雜，隨著時間推移和地域轉變，同源性的差異明顯

同一地區(qū)在不同時間流行的毒株同源性差異顯著，表明毒株隨著時間的改變而不斷發(fā)生變異。長江中游、洞庭湖以南的湖南省2007分離到的3株毒株ck/hu/HG29/07，ck/hu/HB5/07，ck/hu/d14/07分別散步在第Ⅰ系列的各級分支中，與分布在第Ⅲ系列的分支中的長江中游、洞庭湖以北的湖北省的部分分離株ck/hb/8/03，k/hb/L1/07的同源性差異很大，地域跨度不大，分離到毒株的親緣關系卻很遠。另外，同一時間內(nèi)不同區(qū)域流行的毒株變異也很大，表明隨著地域的不同，毒株也發(fā)生不同程度的變異。

3 討論

H9亞型禽流感屬于低致病性疫病，但與其他病原特別是大腸桿菌混合感染能夠提高其致病力，引起產(chǎn)蛋量嚴重下降和死亡率顯著提高，給養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴重的危害。因此及時調(diào)查疫病的發(fā)生情況，及早預警潛在的流感病毒的威脅，為研制有效疫苗提供科學依據(jù)。

從所劃分的基因進化樹來看，大致可分為三個系列，這三個系列毒株分布沒有明顯的地域特點，同一時間段內(nèi)全國流行多系列的毒株，同一地區(qū)可同時流行三個系列毒株；而且，每個系列中的毒株也沒有明顯的時間分布，同一系列分支中包含的毒株時間跨度很大。

H9亞型禽流感疫苗已在我國廣泛使用，但同一地點可能存在遺傳差異較大的不同系列分支的毒株流行，導致使用單一系列毒株制備的疫苗很難控制多系列毒株的流行，因此研制H9亞型多價苗是我國禽流感防控勢在必行的趨勢。

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