程周超 顧興芳 張圣平 苗 晗 張若緯 劉苗苗 楊雙娟

（中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

黃瓜（Cucumis sativus L.）是我國的重要蔬菜作物，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗的黃瓜品種是黃瓜育種者的共同目標（顧興芳 等，2005）。近年來，分子標記輔助選擇（MAS）育種技術的應用，極大地加速了育種進程，然而這依賴于飽和的遺傳圖譜和準確的性狀QTL定位（Tanksley et al.，1989）。由于黃瓜的遺傳基礎狹窄，自 1994年 Kennard將分子標記技術用于遺傳圖譜的構(gòu)建到2009年第一張飽和SSR分子圖譜的完成（Ren et al.，2009）期間，構(gòu)建的主要黃瓜遺傳圖譜（Park et al.，2000；Bradeen et al.，2001；Fazio et al.，2003；Yuan et al.，2007）存在飽和度低、通用標記少、連鎖群與染色體不對應等缺點，第一張飽和SSR遺傳圖譜（Ren et al.，2009）雖然克服了上述缺點，但是沒有對黃瓜的農(nóng)藝性狀進行QTL分析，因此不能將其直接應用于分子標記輔助選擇育種。

黃瓜果實長度是其重要的外觀品質(zhì)性狀。由于消費習慣和用途的不同，各地對黃瓜長度的要求不一，因此，研究控制果實長度的基因，可以為黃瓜品質(zhì)育種提供理論依據(jù)。前人對黃瓜瓜長的QTL進行了一些研究（Kennard & Havey，1995；Serquen et al.，1997；Fazio et al.，2003；Yuan et al.，2007），這些報道中檢測到的瓜長QTL在4～6個之間，但由于所用試驗材料不同，造成QTL數(shù)和位置也不同，同時缺少相同的錨定標記，且已報道的QTL也沒有與相應的染色體對應，使得難于對不同圖譜間的QTL進行準確的比較。

本試驗以黃瓜野生變種PI 183967和新泰密刺選系931雜交獲得的F2群體為作圖群體，構(gòu)建了一張黃瓜SSR遺傳圖譜，并對瓜長進行了QTL定位分析，為黃瓜MAS育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及性狀調(diào)查

試驗材料為黃瓜野生變種PI183967（來源于美國威斯康辛大學）、新泰密刺選系931（來源于中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所）和以兩者為親本的F2、F3群體。

2008年秋分別將兩個親本和F2種植于本所溫室中，F(xiàn)2群體共包含179個單株；2009年春將179個F2：3家系及親本種植在中國農(nóng)業(yè)科學院南口實驗基地溫室內(nèi)，每家系種植10株，均進行常規(guī)栽培管理。當果實長度達到商品瓜大小時測量瓜長，測量標準為正常商品瓜瓜蒂至瓜頂?shù)拈L度（李錫香 等，2005）。取F3各家系內(nèi)瓜長的平均值用于QTL分析。

1.2 遺傳分析

采用DPSv6.55數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件對親本的瓜長數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，應用Excel 2003檢驗瓜長在F2群體及F2：3家系中的分布是否符合正態(tài)分布。

1.3 遺傳圖譜的構(gòu)建

1.3.1 SSR引物的來源 本試驗所用的SSR引物來源于黃瓜全基因組序列，共2112對（Ren et al.，2009）。

1.3.2 SSR分析 從親本和 F2群體 179個單株側(cè)枝上取葉片，冷凍處理后，用改良的 CTAB法（Clark，1998）提取基因組 DNA；SSR 反應體系：總體積 15 μL，1.5 μL 10×PCR buffer，0.2 μL dNTP（2.5 mmol·μL-1），0.15 μL Taq 酶（5 U·μL-1），2 μL DNA（10ng·μL-1），正向、反向引物（50ng·μL-1）各1 μL，其余以ddH2O補足15 μL。PCR程序為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30s，34個循環(huán)；72 ℃保溫5 min；擴增產(chǎn)物用8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠160V恒功率電泳分離，銀染顯色后在觀察燈箱上進行數(shù)據(jù)分析。

1.3.3 標記的選擇 本試驗使用的 SSR標記分兩部分進行選擇：①將利用親本篩選的有多態(tài)性的標記與黃瓜高密度圖譜（Ren et al.，2009）上的標記進行比較分析，從中挑選出條帶清晰、穩(wěn)定，而且沒有定位在高密度圖譜上的SSR標記，全部用于分離群體的遺傳連鎖圖譜構(gòu)建；②為了保證遺傳圖譜上標記分布的均勻性，又從親本篩選出的有多態(tài)性的標記中挑選出了一些標記，這些標記的選擇是根據(jù)它們在黃瓜染色體上的位置，以大約每5 cM的距離進行挑選。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法及圖譜的構(gòu)建 共顯性標記的統(tǒng)計方法：來自母本（PI183967）的帶型記為a，來自父本（931）的帶型記為b，雜合的帶型記為h，未擴增出的或模糊不清的記為u。顯性標記的統(tǒng)計方法：若 P1為顯性，則 F2單株中和 P1帶型一致的記為 d，和 P2帶型一致的記為 b；若P2為顯性，則 F2單株中和 P1帶型一致的記為 a，和 P2帶型一致的記為 c。最后利用 JoinMap3.0（van Ooijen & Voorrips，2001），LOD閾值3.0，分析數(shù)據(jù)獲得黃瓜遺傳圖譜。

1.4 QTL分析與命名

利用MapQTL 4.0分析軟件進行QTL分析，首先以置換測驗確定QTL存在的LOD閾值，然后利用區(qū)間作圖法（IM）進行QTL分析，將最高LOD值所在位置的標記或與其緊密連鎖的標記作為協(xié)同因子，再對IM檢測到的QTL進行多座位QTL模型（Multiple-QTL model，MQM）檢測，以連鎖群上 LOD值最高的位置作為 QTL的位置，以 2-LOD的區(qū)間作為 95 %的置信區(qū)間（van Ooijen，1992）。QTL的命名參照Yuan等（2007）的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 F2遺傳圖譜的構(gòu)建

利用兩構(gòu)圖親本PI183967和931進行多態(tài)性篩選，從2112對引物中，獲得996對多態(tài)性引物，多態(tài)率為47.2 %；從中挑選出319對SSR引物對F2群體進行分析，排除群體分析中條帶模糊不清的標記，最終得到238對可用標記，建立了包含7個連鎖群，234個SSR標記的黃瓜遺傳圖譜（圖1）。該圖譜覆蓋基因組長度829.7 cM，平均圖距3.5 cM。每個連鎖群的標記數(shù)在 20～51之間，LG3包含的標記數(shù)最多，有51個；LG7含有的標記數(shù)最少，只有20個；連鎖群的長度在56.4～158.7 cM之間；圖譜密度在2.7～6.5 cM·maker-1之間，LG4的平均間距最小，為2.7 cM·marker-1；LG2的平均間距最大，為6.5 cM·maker-1。應用MapInspect軟件對該圖譜和黃瓜高密度遺傳圖譜（Ren et al.，2009）進行比較，7個連鎖群上共有86個標記與高密度圖譜一致，本試驗中的1～7個連鎖群中分別有17、12、17、5、9、16、10個標記和高密度圖譜的1～7條染色體對應，從而確定了本試驗構(gòu)建的7個連鎖群和黃瓜7條染色體的對應關系（表1）。

表1 黃瓜F2SSR遺傳圖譜

2.2 瓜長QTL分析

2.2.1 遺傳分析 差異顯著性分析結(jié)果顯示（表2），瓜長在兩親本間表現(xiàn)出極顯著差異，F(xiàn)2群體及F3的瓜長平均值分別為12.74和10.4。標準差分別為2.75和2.24，均表現(xiàn)出明顯的分離。并且其分布為單峰分布，F(xiàn)2群體的峰值為0.23，偏度為-0.26，絕對值均小于 2，是數(shù)量性狀的典型特征；在F3群體中，峰值為1.25，偏度為 4.13，絕對值大于 2，說明對于標準的正態(tài)分布而言，該分布呈尖頂峰，但還是表現(xiàn)出明顯的單峰分布，因此基本符合正態(tài)分布，可用于數(shù)量性狀的定位分析（圖2、3）。

2.2.2 F2群體 QTL定位 用 MapQTL 4.0復合區(qū)間作圖法對 2008年秋季 F2的瓜長進行 QTL分析，共檢測到2個QTL（表3），將其命名為fl1.1和fl1.2，分別位于LG1（Chr1）的SSR02734～SSR05709之間和 LG4（Chr4）的SSR19596～SSR20063之間，fl1.1和fl1.2分別和標記SSR05709和SSR20063更接近，這兩點的貢獻率分別為14.1 %和12.5 %；加性效應為負，表現(xiàn)為減效加性效應，說明這些位點上使果實長度偏短的效應主要來自于黃瓜野生變種PI183967；這兩個QTL的顯性勢（顯性效應和加性效應比值的絕對值）分別為0.21和0.23，根據(jù)Stuber等（1987）提出的QTL作用方式的判別標準，fl1.1和fl1.2均為部分顯性效應。

表2 黃瓜瓜長在親本間的顯著性分析及F2群體和F2:3家系的平均值

圖1 PI183967、新泰密刺931 F2連鎖圖譜及瓜長的QTL位點

圖2 瓜長在黃瓜F2群體的分布

圖3 瓜長在黃瓜F2:3家系的分布

2.2.3 F2:3家系QTL定位 用同樣的作圖方法對2009年春季F2:3家系的瓜長進行QTL分析，共檢測到3個QTL（表3），將其命名為fl1.1、fl4.2和fl6.1，分別位于LG1（Chr1）的SSR03680～SSR19914之間、LG4（Chr4）的 SSR03820～SSR12180之間和 LG6（Chr6）的 SSR15516～SSR23284之間。其中，貢獻率分別為9.4 %、13.3 %和7.1 %，其中fl4.2的貢獻率最高，fl6.1的貢獻率最低；加性效應均為負，表現(xiàn)為減效加性效應，和F2檢測到的QTL的效應相同，也說明了果實長度偏短的效應主要來自于黃瓜野生變種 PI183967；fl1.1、fl4.2和 fl6.1的顯性勢分別為0.19、0.34和0.53，依據(jù)Stuber等（1987）提出的差別標準，fl1.1為加性效應，fl4.2和fl6.1均為部分顯性效應。

表3 黃瓜瓜長在F2群體及F2:3家系的QTL定位

3 討論

基于已經(jīng)構(gòu)建的黃瓜高密度遺傳圖譜（Ren et al.，2009），本試驗有目的地選擇作圖標記，構(gòu)建了SSR遺傳圖譜，該圖譜每個連鎖群上的標記分布都很均勻，不存在較大的間隙，從而有利于進一步的QTL定位；并且除了共有標記外，在該圖譜上還有208對標記沒有在高密度圖譜上得到定位，這也為今后的圖譜整合工作奠定了基礎；通過和高密度圖譜的比較，確立了連鎖群和染色體的對應關系，實現(xiàn)了數(shù)量性狀位點和染色體的對應，為分子標記輔助育種提供了更直觀的依據(jù)。

不同的試驗群體會造成QTL數(shù)和位置的不同（Dijkuizen & Staub，2002）。本試驗中F2：3家系檢測到的瓜長QTL為3個，多于F2檢測到的2個，并且與Owens等（1985）、Lower和Edwards（1986）根據(jù)經(jīng)驗估計控制瓜長的基因數(shù)為4個的結(jié)論較為接近。fl1.2和fl1.1位置相鄰（≤3 cM），在兩個世代間能夠相互對應，推測其可能為同一個QTL，只是由于受到環(huán)境的影響而導致了不同世代間相對位置的微小變化；LG4（Chr4）上的fl4.1和fl4.2相距較遠，且F2：3家系在LG6（Chr6）上檢測了fl6.1，而 F2在該連鎖群上未檢測到瓜長 QTL，這種不同可能是由于兩個世代的環(huán)境條件（溫度、地域等）差異，存在基因型和環(huán)境的互作效應而產(chǎn)生的。

顧興芳，張圣平，王燁.2005.我國黃瓜育種研究進展.中國蔬菜，（12）：1-7.

李錫香，朱德蔚.2005.黃瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社.

張海英，葛風偉，王永健.2004.黃瓜分子遺傳圖譜的構(gòu)建.園藝學報，31（5）：617-622.

Bradeen J M，Staub J E，Wye C，Antonise R，Peleman J.2001.Towards an expanded and integrated linkage map of cucumber（Cucumis sativus L.）.Genome，44：111–119.

Clark M S.1998.Experimentalmanual of plant molecular biology.Beijing：Higher Education Press：427.

Dijkuizen A，Staub J E.2002.QTL conditioning yield and fruit quality traits in cucumber （Cucumis sativus L.）：effects of environment and genetic background.J New Seeds，4：1-30.

Fazio G，Staub J E.2003.Geneticmapping and QTL analysis of horticultural traits in cucumber（Cucumis sativus L.）using recombinant inbred lines.Theor Appl Genet，107：864-874

Fukino N，Ohara T，Monforte A J，Sugiyama M，Sakata Y，Kunihisa M，Matsumoto S.2008.Identification of QTLs for resistance to powdery mildew and SSR markers diagnostic for powdery mildew resistance genes in melon（Cucumis melo L.）.Theor Appl Genet，118（1）：165-175.

Kennard W C，Poetter K，Dijkhuizen A，Meglic V，Staub J E，and Havey M J.1994.Among RFLP，RAPD，isozyme，disease resistance and morphological markers in narrow and wide crosses of cucumber，Theor Appl Genet，89：42-48.

Kennard W C，Havey M J.1995.Quantitative trait analysis of fruit quality in cucumber，QTL detection，confirmation，and comparison with mating-design variation.Theor Appl Genet，91：53-61.

Lower R L，Edwards M D.1986.Cucumber breeding//Bassett M J ed.Breeding vegetable crops，AVI.Westport，Connecticut，USA：173-207.

Owens K W，Bliss F A，Peterson C E.1985.Genetic analysis of fruit length and weight in two cucumber populations using the inbred backcross line method.J Am Soc Hortic Sci，110：431-436.

Park Y H，Sensoy S，Wye C.2000.A geneticmap of cucumber composed of RAPDs，RFLPs，AFLPs，and loci conditioning resistance to papaya ringspot and zucchini yellow mosaic viruses.Genome，43（6）：1003-1010.

Ren Yi，Zhang zhong-hua，Liu Jin-hua，Staub J E，Han Yong-hua，Cheng zhou-chao，Li Xue-feng，Lu Jing-yuan，Miao Han，Kang Hou-xiang，Xie Bing-yan，Gu Xing-fang，Wang Xiao-wu，Du Yong-chen，Jin Wei-wei，Huang San-wen.2009.An integrated genetic and cytogeneticmap of the cucumber genome.PloS ONE，4（6）：e5795.

Serquen F C，Bacher J，Staub J E.1997.Mapping and QTL analysis of horticultural traits in a narrow cross in cucumber（Cucumis sativus L.）using random amplified polymorphic DNA makers.Molecular Breeding，3（4）：257-268.

Stuber C W，Edwards M D，Wendel J F.1987.Molecular marker-facilitated investigations of quantitative trait loci in maize.Factors influencing yield and its component traits.Crop Science，27（3）：639-648.

Tanksley S D，Young N D，Paterson A H，Bonierbale M W.1989.RFLP mapping in plant breeding：new tools for an old science.Nature Biotechnology，7：247-264.

van Ooijen J W.1992.Accuracy of mapping quantitative trait loci in autogamous species.Theor Appl Genet，84：803-811.

van Ooijen J，Voorrips R.2001.JoinMap3.0，software for calculation of genetic linkage maps.Wageningen：Plant Research International.

Yuan X J，Li X Z，Pan J S，Wang G，Jiang S，Li X H，Deng S L，He H L，Si M X，Lai L，Wu A Z，Zhu L H，Cai R.2007.Genetic linkage map construction and location of QTLs for fruit-related traits in cucumber.Plant Breeding，127：180–188.