高文平，楊大堅，胡四琴，鄒德學(xué)，曾薇，徐彷周，郭靜，袁勁松#（.北京大學(xué)深圳醫(yī)院，深圳市 5806；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，汕頭市 5504；.香港理工大學(xué)深圳研究院，深圳市 5806）

檳榔（Areca catechu L.）是棕櫚科植物檳榔的干燥成熟種子，是一種常用中藥，位居我國著名四大南藥之首。檳榔嚼塊是檳榔果實或果實與其它添加物混合的咀嚼物，目前全世界約有6億人咀嚼檳榔嚼塊。有研究表明，檳榔嚼塊的流行與致癌、致突變、神經(jīng)精神毒性、生殖毒性等有關(guān)[1]。生物堿是檳榔果實的主要活性成分，而研究檳榔堿對人精子質(zhì)量影響的報道較少。本試驗優(yōu)選正常男性精子與不同濃度檳榔堿溶液共孵育，采用計算機輔助的精子分析系統(tǒng)（CASA）觀察不同濃度檳榔堿溶液對人精子活率、活力、速度等指標(biāo)的影響。

1 材料

1.1 儀器

CASA（北京清華同方軟件股份有限公司）；DK-8A型電熱恒溫水槽（上海精密實驗設(shè)備有限公司）；0412-1型MACRO精子計數(shù)板（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥

小牛血清白蛋白（BSA，美國Sigma公司）、Ham's F10培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；氫溴酸檳榔堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：111684-200401）。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)本收集

按WHO推薦的試驗方法及標(biāo)準(zhǔn)[2]，從本院男科門診送檢的精液標(biāo)本中，收集50例正常成年男性精液。年齡22～30歲。取樣方法為：禁欲3～5 d，取樣前48 h禁飲酒和咖啡等對精子有影響的食物或藥物，手淫法收集標(biāo)本于干凈的容器并及時送驗。

2.2 試液制備和精子優(yōu)選

2.2.1 精子優(yōu)選液的制備：取10 mL Ham's F10培養(yǎng)液，加入BSA 35 mg，調(diào)節(jié)pH值至7.4，用0.22 μm微孔薄膜過濾除菌，備用。

2.2.2 檳榔堿溶液的制備：取檳榔堿，用精子優(yōu)選液分別配制成10、50、100 μg·mL-1，調(diào)節(jié)滲透壓為290 mosm·kg-1的檳榔堿溶液。

2.2.3 精子優(yōu)選：按文獻(xiàn)方法[3]加以改良。取1支10 mL一次性醫(yī)用注射器，抽入2 mL空氣后再抽入精子優(yōu)選液2 mL，最后緩慢抽入精液1.5 mL，避免震動，使精液與優(yōu)選液分界清楚，將注射器針頭護(hù)嘴套上，置注射器于37℃恒溫水浴箱內(nèi)的支架上固定（注射器按其內(nèi)部的優(yōu)選液和精液所呈現(xiàn)的交界面積最大的角度放置）。孵育45 min后緩慢直立，推棄優(yōu)選液下方的精液，收集富含優(yōu)選精子的優(yōu)選液，500 r·min-1離心5 min，吸棄離心管中的上清液，用新鮮的優(yōu)選液緩慢均勻吹散精子團(tuán)塊，并用新鮮的優(yōu)選液調(diào)節(jié)終濃度至（40～80）×106·mL-1。

2.3 分組與孵育

試驗分為4組，即對照（精子優(yōu)選液）及檳榔堿高、中、低濃度（100、50、10 μg·mL-1）組。置于37 ℃恒溫水浴箱培養(yǎng)，分別孵育0.5、1和2 h。

2.4 CASA進(jìn)行分析

吸取充分混溶的孵化后的精子懸液10 μL，加到預(yù)溫的MACRO精子計數(shù)板的樣品槽中。將計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，采用20×反相物鏡選擇8個視野檢測，8個視野檢測的精子總數(shù)不少于300個精子，用顯微攝像機和錄像機記錄精子的運動圖像，進(jìn)行軟件處理，即得各運動參數(shù)：精子活率（Mot，%）、a+b級運動精子百分率[（a+b）PM，%]、曲線速度（VCL，μm·s-1）、直線速度（VSL，μm·s-1）。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2.6 檳榔堿對人體外精子運動能力參數(shù)影響試驗結(jié)果

經(jīng)CASA分析，不同時間段檳榔堿溶液對體外Mot有顯著影響，使Mot降低。與對照組比較，檳榔堿低濃度組1、2 h后Mot顯著下降（P＜0.01）；檳榔堿高、中濃度組0.5、1、2 h后Mot顯著下降（P＜0.01）。不同時間段檳榔堿溶液使（a+b）PM下降。與對照組比較，檳榔堿高、中濃度組0.5、1、2 h后（a+b）PM顯著下降（P＜0.01或P＜0.05）。與對照組比較，不同時間段高、中濃度組VCL顯著下降（P＜0.01）；檳榔堿低濃度組2 h后VCL顯著下降（P＜0.01）。不同時間段檳榔堿溶液使VSL下降。與對照組比較，檳榔堿高、中濃度組0.5、1、2 h后VSL均顯著下降（P＜0.01或P＜0.05）?？梢?，檳榔堿溶液在不同作用時間和不同作用濃度的情況下，精子各運動參數(shù)均有顯著性差異。檳榔堿濃度越高，作用時間越長，精子運動能力越低，從而說明檳榔堿能降低正常男性體外精子運動能力且與濃度時間成正比。不同時間段檳榔堿溶液對Mot、（a+b）PM、VCL、VSL的影響分別見表1、表2、表3、表4。

表1 不同時間段檳榔堿溶液對Mot的影響（，n＝50）Tab 1 Influence of Ar solution on the Mot of sperm in different period（，n＝50）

表1 不同時間段檳榔堿溶液對Mot的影響（，n＝50）Tab 1 Influence of Ar solution on the Mot of sperm in different period（，n＝50）

與對照組比較：＊P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01

2時間/h 1組別對照組檳榔堿低濃度組檳榔堿中濃度組檳榔堿高濃度組59.13±6.5556.65±5.18＊54.85±9.79＊29.59±8.79＊濃度/μg·mL－1 010501000.569.80±5.2972.31±7.4061.72±7.97＊42.95±7.73＊66.87±6.1662.24±9.37＊58.43±7.78＊37.89±6.84＊

表2 不同時間段檳榔堿溶液對（a+b）PM的影響（，n＝50）Tab 2 Influence of Ar solution on the（a+b）PM of sperm in different period（，n＝50）

表2 不同時間段檳榔堿溶液對（a+b）PM的影響（，n＝50）Tab 2 Influence of Ar solution on the（a+b）PM of sperm in different period（，n＝50）

與對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

2時間/h組別對照組檳榔堿低濃度組檳榔堿中濃度組檳榔堿高濃度組濃度/μg·mL－1 010501000.554.61±6.3153.74±4.1551.03±7.80＊35.44±9.57＊＊150.43±6.8347.66±8.1344.10±6.87＊＊29.69±8.15＊＊42.87±6.4041.38±7.3238.12±8.72＊＊22.82±7.59＊＊

表3 不同時間段檳榔堿溶液對VCL的影響（，n＝50）Tab 3 Influence of Ar solution on the VCL of sperm in different period（，n＝50）

表3 不同時間段檳榔堿溶液對VCL的影響（，n＝50）Tab 3 Influence of Ar solution on the VCL of sperm in different period（，n＝50）

與對照組比較：＊P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01

組別對照組檳榔堿低濃度組檳榔堿中濃度組檳榔堿高濃度組時間/h劑量/μg·mL－1 010501002124.70±3.3320.46±4.24＊13.71±6.03＊12.55±5.34＊0.530.79±3.9229.91±3.6928.49±4.53＊26.21±2.32＊27.32±3.8326.79±4.4422.94±3.31＊20.33±3.9＊

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的檳榔堿溶液，作用一定時間后，對正常人精子體外運動各參數(shù)均有影響。

表4 不同時間段檳榔堿溶液對VSL的影響（，n＝50）Tab 4 Influence of Ar solution on the VSL of sperm in different period（，n＝50）

表4 不同時間段檳榔堿溶液對VSL的影響（，n＝50）Tab 4 Influence of Ar solution on the VSL of sperm in different period（，n＝50）

與對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別對照組檳榔堿低濃度組檳榔堿中濃度組檳榔堿高濃度組時間/h劑量/μg·mL－1 010501000.517.20±2.9716.66±3.6915.49±3.86＊＊10.24±2.37＊＊1213.00±3.9612.56±4.819.21±2.98＊＊7.97±2.85＊＊15.04±3.1213.74±4.0513.46±4.49＊10.24±2.37＊＊

近年來，男性不育成逐年遞增的趨勢，導(dǎo)致男性不育的原因主要有精子數(shù)目減少、精子活力或受精能力低下，而足夠的精子數(shù)量和適當(dāng)?shù)倪\動能力是男性生殖能力的重要保障，在毒理學(xué)上已將精子計數(shù)、精子形態(tài)以及精子活動力作為男性生殖健康的重要判斷指標(biāo)[4]。藥源性生殖功能損害雖然不會威脅生命，但會影響性生活質(zhì)量和懷孕能力，也影響藥物治療的依從性[5]。目前，關(guān)于檳榔堿對精子運動能力各參數(shù)的影響主要集中在動物實驗，而檳榔堿直接對人精子運動參數(shù)的影響報道較少。

文獻(xiàn)報道檳榔嚼塊和檳榔堿存在致癌的副作用[6]，印度學(xué)者M(jìn)ukhefiee-A等曾報道檳榔對雄性小鼠生殖細(xì)胞有負(fù)面影響。胡怡秀等[7，8]采用小鼠交配實驗觀察檳榔提取液對雄性小鼠生育力的影響，發(fā)現(xiàn)雌鼠的受孕率呈現(xiàn)出隨劑量增加而下降的劑量反應(yīng)關(guān)系，各實驗組仔鼠出生時體質(zhì)量顯著低于對照組，表明檳榔對雄性小鼠生育能力及仔鼠生長發(fā)育可能存在一定影響；采用精子計數(shù)、精子活動率、精子形態(tài)學(xué)指標(biāo)觀察了檳榔水提取液對雄性小鼠精子的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檳榔能使小鼠精子數(shù)量顯著減少、精子活動率顯著降低、精子畸形率顯著升高；采用小鼠交配實驗，觀察了檳榔對小鼠撲捉潛伏期、交配潛伏期、平均撲捉次數(shù)、平均交配次數(shù)、撲捉動物數(shù)和交配動物數(shù)的影響，結(jié)果表明檳榔可導(dǎo)致小鼠性功能顯著減低。

精子本身的結(jié)構(gòu)特點和物質(zhì)基礎(chǔ)決定了精子具有活躍運動的生物學(xué)特征，這也是正常生理狀態(tài)下完成受精過程的基礎(chǔ)。各種因素造成的精子功能障礙和結(jié)構(gòu)異常可以通過精子的運動表現(xiàn)出來，而CASA系統(tǒng)可以客觀、精確、準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)多種因素對精子運動的影響。常用的精子運動參數(shù)包括：Mot，是表示前向運動精子與精子總數(shù)的比值；a級向前運動精子百分率，即快速前向運動（即37℃時速度≥25 μm·s-1，或20℃速度≥20 μm·s-1）精子占精子總數(shù)的比值；b級前向運動精子百分率，即慢速或呆滯的前向運動精子占精子總數(shù)的比值；VSL，是指精子從運動的起始點到終點的位移與所需時間的比值；VCL，是指精子從運動的起始點到終點的運動軌跡路程與時間的比值。已有研究表明，精子的VCL、VSL等運動參數(shù)與受精率呈顯著相關(guān)關(guān)系。因此，精子的運動特點是綜合反映精子質(zhì)量最直觀、敏感的指標(biāo)。

本研究應(yīng)用CASA系統(tǒng)，觀察了不同濃度檳榔堿溶液對正常男性精子體外運動能力的影響，結(jié)果顯示隨著檳榔堿濃度的增高和時間的延長，正常男性體外精子運動能力顯著降低。本課題組已有研究表明，50、100 μg·mL-1等較高濃度檳榔堿溶液在作用一定時間后，Mot、（a+b）PM、VCL、VSL等精子運動各參數(shù)均有顯著降低。本研究進(jìn)一步證明檳榔堿具有生殖毒性作用，為檳榔堿具有雄性生殖毒性提供了直接證據(jù)。此結(jié)果還提示，隨著檳榔堿濃度和作用時間的增加，其對精子的毒性作用越來越強。

本研究方法具有耗時短、影響因素易于控制等特點，但是本試驗未能闡述檳榔堿對正常男性精子體外運動能力影響的作用機制，也未能闡述食用檳榔是否對男性生殖功能有直接影響，這些還有待于進(jìn)一步研究。

[1]趙云霞，于 蕾，季宇彬，等.檳榔的毒理研究進(jìn)展[J].藥品評價，2006，6：457.

[2]谷翊群，陳振文，于和鳴，等.WHO人類精液及精子-宮頸黏液相互作用試驗手冊[M].第4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：3.

[3]王學(xué)本，李科茂.簡易上游法優(yōu)選精子治療少、弱精子癥的臨床應(yīng)用[J].中國男科學(xué)雜志，1998，12（4）：224.

[4]Harada S，Sakaguchi Y，Shimada M，et al.Male reproductive toxicity study of nefiracetam in rats[J].Toxicol Sei，1995，20（3）：309.

[5]馮艷梅，楊劍弘.藥源性生殖功能損害[J].中國藥房，2008，19（14）：1104.

[6]Hazarey VK，Erlewad DM，Mundhe KA，et al.Submucous fibrosis：study of 1000 cases from central India[J].Oral Pathol Med，2007，36（1）：12.

[7]胡怡秀，臧雪冰，丘 豐，等.檳榔對雄性小鼠性功能的影響[J].中國公共衛(wèi)生學(xué)報，1999，18（1）：27.

[8]胡怡秀，臧雪冰，丘 豐，等.檳榔對小鼠精子的影響研究[J].癌變畸變突變，1999，11（1）：39.