余曉東，武夏明，劉田云，趙廣成，劉逢芹（.山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院，濟(jì)南市 5004；.山東大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南市 500）

隨著社會人群老齡化趨勢的發(fā)展，缺血性腦病（中風(fēng)）發(fā)病率呈上升趨勢[1，2]。酮通顆粒原處方是本院臨床協(xié)定方，在臨床上應(yīng)用多年，療效確切。筆者在此方劑基礎(chǔ)上研制開發(fā)的制劑酮通顆粒具有活血通絡(luò)、祛瘀通脈的作用。為更好地控制該制劑質(zhì)量，筆者對其進(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

1 儀器與試藥

Mettler AE-241型電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；515型高效液相色譜（HPLC）儀（美國Waters公司）；Model 500 labAlliance檢測器（美國SSI公司）；ANASTAR數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國SUNTEK公司）；KQ-100D型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海博迅有限公司）；HHS-118型恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）。

槲皮素、山柰素、異鼠李素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為 100081-200406、110861-200606、110860-200407）；銀杏葉、三七、葛根對照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為 110866-200803、120941-200807、121178-200302）；酮通顆粒由本院制劑室制備（規(guī)格：雙鋁箔復(fù)合袋包裝，每袋5 g，批號：080311）；甲醇（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20070110）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司，批號：1222YS）；硅膠G、硅膠H（青島海洋化工有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 三七的TLC鑒別 精密稱取樣品3 g，加入數(shù)滴水浸潤、攪勻，加以水飽和的正丁醇30 mL，超聲30 min，放置2 h，離心，取上清液，加30 mL的正丁醇飽和水，搖勻，放置使分層，取正丁醇層，蒸干，殘?jiān)铀芙夂笥靡颐演腿?次（每次20 mL），棄去乙醚液，水層溶液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液；取三七對照藥材0.5 g，加入70%乙醇15 mL，超聲30 min，過濾，濾液蒸去乙醇后加水溶解，用乙醚萃取2次（每次20 mL），棄去乙醚液，水層用正丁醇萃取2次（每次20 mL），取正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為對照藥材溶液；按酮通顆粒制備工藝制得缺三七藥材的陰性樣品，同法制得陰性對照溶液。吸取上述3種溶液各3μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）在10℃以下放置的下層溶液為展開劑，上行展開10 cm，取出，晾干，噴以10%H2SO4-乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置365 nm紫外光燈下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對照無干擾。三七的TLC見圖1。

2.1.2 銀杏葉的TLC鑒別[3]精密稱取樣品2 g，加甲醇20 mL，加熱回流10 min，放冷，濾過，濾液蒸干，加水20 mL溶解，氯仿萃取2次（每次20 mL），水層蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液；取銀杏葉對照藥材0.5 g，加甲醇10 mL，加熱回流，放冷濾過，溶液蒸干，加水10 mL溶解，氯仿萃取2次（每次10 mL），水層蒸干，殘?jiān)蛹状既芙庵频脤φ账幉娜芤?；取槲皮素對照品，加甲醇制成? mL含0.03 mg的溶液，作為對照品溶液；按酮通顆粒制備工藝制得缺銀杏葉藥材的陰性樣品，同法制備陰性對照溶液。吸取上述4種溶液各6μL，分別點(diǎn)于同一含4%醋酸鈉的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲醇-水（5∶3∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙酸溶液，熱風(fēng)吹干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對照無干擾。銀杏葉的TLC見圖2。

2.1.3 葛根的TLC鑒別 稱取樣品3 g，加甲醇30 mL，超聲30 min，放置2 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液；取葛根對照藥材0.5 g，加甲醇15 mL，超聲30 min，放置2 h，取上清液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為對照藥材溶液；按處方比例制備缺葛根的陰性樣品，同法制得陰性對照溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（7∶2.5∶0.25）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對照無干擾。葛根的TLC見圖3。

圖1 三七的TLC1.供試品；2.陰性對照；3.三七對照藥材Fig 1 TLC of P.notoginseng1.test sample；2.negative control；3.Radix Notoginseng

圖2 銀杏葉的TLC1.陰性對照；2.槲皮素對照品；3.銀杏葉對照藥材；4.供試品Fig 2 TLC of G.biloba1.negative control；2.quercetin control；3.Folium Ginkgo；4.test sample

圖3 葛根的TLC1.陰性對照；2.葛根對照藥材；3.供試品Fig 3 TLC of P.lobata1.negative control；2.Radix Puerariae；3.test sample

2.2 定量分析

2.2.1 溶液的制備[4，5]取樣品2 g，精密稱定（約相當(dāng)于銀杏葉藥材1 g），加甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1）25 mL，置水浴中加熱回流30 min，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；按酮通顆粒制備工藝制得缺三七藥材的陰性樣品，同法制得陰性對照溶液；再分別精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過夜的槲皮素對照品2.62 mg、山柰素對照品2.28 mg、異鼠李素對照品1.24 mg，置于同一25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋到刻度，制得混合對照品溶液。

2.2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱：Diamond C18（250 mm×4.5 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.4%H3PO4（55∶45）；流速：1 mL·min-1；檢測波長：360 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；柱壓＜1200 Pa。理論塔板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。色譜見圖4。

2.2.3 線性關(guān)系考察 按上述色譜條件，精密吸取上述混合對照品溶液0.5、1、2、4、6、8 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，注入液相色譜儀，測得峰面積。以槲皮素、山柰素、異鼠李素濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，并分別進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，見表1。

圖4 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.陰性對照；C.供試品；1.槲皮素；2.山柰素；3.異鼠李素Fig 4 HPLC chromatogramsA.mixture control；B.negative control；C.test sample；1.meletin；2.kaempferide；3.isorhamnetin

表1 總黃酮醇苷的回歸方程及線性范圍Tab 1 Regression equation and linear range of total flavonol glyconsides

2.2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對照品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，峰面積的RSD分別為槲皮素1.21%、山柰素0.83%、異鼠李素1.63%。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一混合對照品溶液和供試品溶液各20μL，每間隔2 h進(jìn)一針，連續(xù)考察8 h。結(jié)果，對照品峰面積的RSD分別為槲皮素0.31%、山柰素0.72%、異鼠李素0.59%，供試品峰面積的RSD分別為槲皮素1.68%、山柰素1.74%、異鼠李素1.92%。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，精密稱取5份，按樣品測定項(xiàng)下的方法測定。結(jié)果，槲皮素、山柰素、異鼠李素的RSD分別為2.88%、4.61%、1.80%。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批樣品適量，共5份，精密稱定，分別精密加入槲皮素、山柰素、異鼠李素對照品溶液各1 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，照樣品測定項(xiàng)下的方法測定。結(jié)果，平均回收率分別為96.21%、99.14%和95.00%，RSD分別為2.06%、1.19%、1.31%。

2.2.8 樣品含量測定 稱取3份酮通顆粒，每份各2 g，精密稱定，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制得供試品溶液。吸取同批號供試品溶液和槲皮素濃度為62.88 μg·mL-1、山柰素濃度為54.72 μg·mL-1、異鼠李素濃度為29.76 μg·mL-1的對照品溶液各20 μL，依照“2.2.2”項(xiàng)下方法測定，記錄各峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算總黃酮醇苷含量（總黃酮醇苷含量＝（槲皮素含量+山柰素含量+異鼠李素含量）×2.51），結(jié)果見表2。

表2 樣品總黃酮醇苷含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Content determination of total flavonol glyconsides in samples（n＝3）

3 討論

本試驗(yàn)建立了酮通顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用TLC對處方中銀杏葉、三七、葛根進(jìn)行了定性鑒別，采用HPLC建立了銀杏葉總黃酮醇苷的含量測定方法，并經(jīng)多批次檢驗(yàn)，方法可行，結(jié)果重復(fù)性較好。

本制劑中銀杏葉總黃酮醇苷是其主要藥效成分，直接影響到治療效果，故選擇測定銀杏葉總黃酮醇苷作為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的含量測定方法。該標(biāo)準(zhǔn)的建立對于保證制劑質(zhì)量、縮小制劑批間差異、確保臨床療效具有重要意義。

[1]李留霞.論缺血性腦中風(fēng)的發(fā)病機(jī)理[J].光明中醫(yī)，2007，22（5）：14.

[2]劉亞敏，徐秋英.中醫(yī)藥治療缺血性中風(fēng)的現(xiàn)狀[J].長春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，18（2）：57.

[3]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：220.

[4]李彥博，孫 靜，弭 瑋，等.銀杏葉中總黃酮醇苷的含量測定[J].中國實(shí)用醫(yī)藥，2008，3（6）：16.

[5]羅 瑛，高秋芳.高效液相色譜法測定銀杏磷脂膠囊中總黃酮醇苷的含量[J].中外健康文摘（臨床醫(yī)藥版），2007，4（10）：16.