李藝文， 唐志書*， 張 珍*， 宋忠興， 王昌利,2， 馬虎強(qiáng)

[1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育)/陜西中藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，陜西 咸陽 712083；2.內(nèi)蒙古海天制藥有限公司，內(nèi)蒙 通遼 028000]

腎臟纖維化是所有慢性腎臟病病變發(fā)展至終末期腎臟疾病的最后共同通路，是慢性腎臟病的主要病理基礎(chǔ)。目前臨床上用于治療的一線藥物主要有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素受體拮抗劑(ARB)等，盡管有這些藥物，但是仍不能有效阻止腎纖維化發(fā)生發(fā)展，還會(huì)出現(xiàn)一系列的不良反應(yīng)，如ACEI所致咳嗽和嚴(yán)重的高血鉀癥等[1]。因此，尋找有效減緩腎臟纖維化進(jìn)程的活性成分已成為抗腎臟纖維化治療的關(guān)鍵。

異鼠李素是從銀杏、沙棘等藥用植物中分離提純的黃酮類化合物，研究表明，異鼠李素具有廣泛的藥理作用，在治療心腦血管疾病、抑制脂肪細(xì)胞分化、抗病毒、抗炎、耐缺氧、降糖等方面扮演了較為重要的角色[2]。近年來，有關(guān)異鼠李素的研究越來越多。Yang等[3]發(fā)現(xiàn)異鼠李素通過抑制TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和減少氧化應(yīng)激，從而減緩肝臟纖維化；Zheng等[4]發(fā)現(xiàn)異鼠李素通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的形成保護(hù)爭(zhēng)光霉素誘導(dǎo)的肺纖維化；Liu等[5]人發(fā)現(xiàn)異鼠李素通過TGF-β1/Smad3和TGF-β1/p38 MAPK通路抑制自噬和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的形成進(jìn)而抑制肝臟纖維化，也有研究報(bào)道異鼠李素可減輕小鼠非酒精性脂肪肝炎引起的脂肪變性和肝臟纖維化[6]。異鼠李素具有抗肺纖維化和肝纖維化的作用，那么是否具有抗腎臟纖維化的作用研究還未見報(bào)道，本研究建立單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstructive，UUO)大鼠腎臟纖維化和NRK-52E細(xì)胞纖維化模型，從體內(nèi)和體外研究了異鼠李素對(duì)腎臟纖維化的作用及其機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞研究所。

1.2 動(dòng)物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±10)g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(川)2020-030。

1.3 試劑與藥物 異鼠李素對(duì)照品，中國食品藥品檢定研究院(批號(hào)110860-2016115，純度99.8%)。血管緊張素Ⅱ(批號(hào)4474-91-3)，購自美國Medcham Express公司；α-SMA、E-cadherin、Connexin 43(貨號(hào)14968s、14472s、3512s)，購自美國Cell Signaling Technology公司；β-actin(貨號(hào)361438ws)，購自美國CMCTAG公司；TGF-β1(貨號(hào)21898-1-AP)，購自美國Proteintech公司；山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗(HRP標(biāo)記，貨號(hào)102618190226、121918190213)，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ROS/超氧化物檢測(cè)試劑盒，購自美國Enzo Life Sciences公司；內(nèi)源性H2S檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)A146-1-1)，購自南京建成生物工程研究所。

1.4 儀器 311型細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)(江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司)；DSZ2000X型倒置顯微鏡(重慶澳浦光電技術(shù)有限公司)；LD5-2A型低速離心機(jī)(北京雷博爾離心機(jī)有限公司)；Thermo Multiskan GO多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；Western blot曝光儀器ChemiDoc XRS+(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 造模組用1%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉大鼠，在腹部左側(cè)切口，分離左側(cè)輸尿管，輸尿管在近端中上1/3處雙結(jié)扎，然后在2個(gè)結(jié)扎處之間將輸尿管剪斷，最后逐層縫合腹腔；假手術(shù)組只需將輸尿管分離出來，不進(jìn)行結(jié)扎和剪斷輸尿管操作。實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、UUO組、依那普利+UUO組、異鼠李素(10、30 mg/kg)+ UUO組，每組10只，手術(shù)前3天給藥，術(shù)后連續(xù)給藥2周。

2.2 取材 術(shù)后2周，用1%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉大鼠，摘除眼球采血，分離血清，密閉保存于-80 ℃冰箱。摘取腎臟，除去腎包膜，用4 ℃生理鹽水沖洗，從中間縱切，1/2固定于4%多聚甲醛緩沖液，1/2制備蛋白勻漿。

2.3 腎組織形態(tài)學(xué)觀察

2.3.1 腎臟皮質(zhì)厚度測(cè)量 將固定后的1/2腎臟取出，觀察UUO導(dǎo)致大鼠腎臟大小和腎盂擴(kuò)張情況，腎臟縱切面測(cè)量腎皮質(zhì)厚度。

2.3.2 Masson染色 大鼠腎組織用4%多聚甲醛緩沖液固定24 h，石蠟包埋、切片，進(jìn)行Masson染色。觀察腎小管擴(kuò)張、管型形成和間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，并采用Image J軟件對(duì)膠原纖維的藍(lán)色陽性染色進(jìn)行定量分析。

2.3.3 免疫組化 石蠟切片脫蠟、水化后，置于枸櫞酸緩沖液中煮沸15 min，置3% H2O2中滅活，3% BSA室溫封閉1 h，孵育α-SMA一抗，置于4 ℃冰箱中過夜，室溫孵育二抗1 h，按DAB顯色試劑盒說明配制顯色液，滴加后鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，洗滌、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片，陽性表達(dá)呈棕黃色或深棕色染色。采用Image J軟件，對(duì)陽性表達(dá)進(jìn)行定量分析。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng) NRK-52E細(xì)胞置于含5%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，加入雙抗(青霉素100 U/mL、鏈霉素0.1 mg/mL)，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

2.5 細(xì)胞增殖檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長期NRK-52E細(xì)胞，以2.5×108/mL密度接種在96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁并長滿。加入異鼠李素(0、1、2.5、5、10、25、50 μmol/L)，72 h后每孔加入10 μL CCK-8檢測(cè)溶液，顯色后采用多功能酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)各孔吸光度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.6 Western blot檢測(cè) 將細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板中，長滿后加藥刺激，刺激結(jié)束后加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，提取總蛋白，采用BCA試劑盒定量，取50 μg蛋白樣品，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗4 ℃過夜，PBST洗膜，加入二抗，孵育1 h，洗膜后ECL發(fā)光試劑顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照。采用Image J軟件，對(duì)所得條帶進(jìn)行定量，以β-actin為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 血清H2S水平檢測(cè) 取600 μL血清，按照內(nèi)源性H2S檢測(cè)試劑盒說明操作，顯色后在665 nm波長處檢測(cè)吸光度，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.8 活性氧、超氧化物水平檢測(cè) 將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，長滿后加藥刺激24 h，加入活性氧(ROS)檢測(cè)試劑(綠色)或超氧化物檢測(cè)試劑(橙色)與細(xì)胞孵育20 min，按照試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)操作，在熒光顯微鏡下拍照。采用多功能酶標(biāo)儀，檢測(cè)ROS(490/525 nm)、超氧化物(550/620 nm)水平。

3 結(jié)果

3.1 異鼠李素改善UUO大鼠腎組織形態(tài)和皮質(zhì)厚度 表1、圖1顯示，UUO大鼠腎臟增大、腎盂擴(kuò)張、皮質(zhì)變薄，在造模第14天更明顯；給予異鼠李素干預(yù)后，可顯著改善大鼠腎臟形態(tài)和皮質(zhì)厚度(P<0.01)。

表1 異鼠李素對(duì)UUO大鼠腎臟皮質(zhì)厚度的影響

圖1 異鼠李素對(duì)UUO大鼠腎臟形態(tài)的影響

3.2 異鼠李素減少UUO大鼠膠原纖維的沉積 圖2顯示，與假手術(shù)組比較，UUO組大鼠腎臟膠原纖維大量沉積(P<0.01)，表明造模成功；與UUO組比較，異鼠李素高、低劑量組大鼠膠原纖維減少(P<0.01)，其中高劑量組效果優(yōu)于依那普利組(P<0.05)。

注：a～e分別為假手術(shù)組、UUO組、依那普利組、異鼠李素(10 mg/kg)組、異鼠李素(30 mg/kg)組。與假手術(shù)組比較，##P<0.01；與UUO組比較，**P<0.01；與依那普利組比較，◆P<0.05。

3.3 異鼠李素抑制UUO大鼠α-SMA蛋白表達(dá) 圖3顯示，與假手術(shù)組比較，UUO組大鼠腎臟組織α-SMA表達(dá)升高(P<0.05)；與UUO組比較，異鼠李素高、低劑量組大鼠腎臟組織α-SMA表達(dá)降低(P<0.05)，其中高劑量組效果優(yōu)于依那普利組(P<0.05)。

注：a～e分別為假手術(shù)組、UUO組、依那普利組、異鼠李素(10 mg/kg)組、異鼠李素(30 mg/kg)組。與假手術(shù)組比較，#P<0.05；與UUO組比較，*P<0.05；與依那普利組比較，◆P<0.05。

3.4 異鼠李素升高UUO大鼠血清H2S水平 圖4顯示，與假手術(shù)組比較，UUO組大鼠血清H2S水平下降(P<0.01)；與UUO組比較，異鼠李素組大鼠血清H2S水平上升(P<0.05)。

注：a～e分別為假手術(shù)組、UUO組、依那普利組、異鼠李素(10 mg/kg)組、異鼠李素(30 mg/kg)組。與假手術(shù)組比較，##P<0.01；與UUO組比較，*P<0.05。

3.5 異鼠李素抑制UUO大鼠NRK-52E細(xì)胞的增殖 圖5顯示，與對(duì)照組比較，2.5～50 μmol/L異鼠李素對(duì)UUO大鼠NRK-52E細(xì)胞有抑制作用(P<0.05，P<0.01)，在50 μmol/L下最明顯。

注：與對(duì)照組(異鼠李素0 μmol/L)比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.6 異鼠李素抑制NRK-52E細(xì)胞上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的形成 圖6A～6C顯示，不同濃度(1.0×10-9、1.0×10-8、1.0×10-7mol/L)AngⅡ能升高α-SMA表達(dá)，降低E-cadherin表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，表明模型建立成功；圖6D～6F顯示，10、25、50 μmol/L異鼠李素干預(yù)后，可抑制α-SMA表達(dá)升高、E-cadherin表達(dá)降低(P<0.01)；圖6G～6H顯示，異鼠李素能降低TGF-β1表達(dá)(P<0.01)。

注：與血管緊張素Ⅱ(0 μmol/L)組比較，#P<0.05，##P<0.01。a～d分別為血管緊張素Ⅱ(1.0×10-8 mol/L)組、血管緊張素Ⅱ(1.0×10-8 mol/L)+異鼠李素(10 μmol/L)組、血管緊張素Ⅱ(1.0×10-8 mol/L)+異鼠李素(25 μmol/L)組、血管緊張素Ⅱ(1.0×10-8 mol/L)+異鼠李素(50 μmol/L)組。與a組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.7 異鼠李素降低NRK-52E細(xì)胞活性氧水平 圖7顯示，異鼠李素干預(yù)24 h后可抑制ROS的產(chǎn)生(P<0.05，P<0.01)，并呈劑量依賴性，但對(duì)超氧化物水平無明顯影響(P>0.05)。

注：A為細(xì)胞活性氧和超氧化物熒光染色，B為細(xì)胞活性氧水平，C為細(xì)胞超氧化物水平，a～d分別為血管緊張素Ⅱ(1.0×10-8 mol/L)組、血管緊張素Ⅱ(1.0×10-8 mol/L)+異鼠李素(10 μmol/L)組、血管緊張素Ⅱ(1.0×10-8 mol/L)+異鼠李素(25 μmol/L)組、血管緊張素Ⅱ(1.0×10-8 mol/L)+異鼠李素(50 μmol/L)組。與a組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

在腎臟纖維化進(jìn)展過程中，許多細(xì)胞因子和信號(hào)通路參與其中，其中TGF-β1在纖維化的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。TGF-β1主要介導(dǎo)TGF-β1/Smads和非Smad信號(hào)通路的激活，從而引起EMT的形成，它的形成表現(xiàn)為上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下降，肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志α-SMA表達(dá)增加，使系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞等轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞，最終導(dǎo)致ECM進(jìn)行性積聚，而ECM的降解減少，將導(dǎo)致腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致腎功能喪失[1,7]。

3.8 異鼠李素抑制NRK-52E細(xì)胞中Cx43的表達(dá) 圖8顯示，異鼠李素能抑制細(xì)胞間隙連接蛋白Cx43表達(dá)(P<0.05)，并呈劑量依賴性。

注：a～d分別為血管緊張素Ⅱ(1.0×10-8 mol/L)組、血管緊張素Ⅱ(1.0×10-8 mol/L)+異鼠李素(10 μmol/L)組、血管緊張素Ⅱ(1.0×10-8 mol/L)+異鼠李素(25 μmol/L)組、血管緊張素Ⅱ(1.0×10-8 mol/L)+異鼠李素(50 μmol/L)組。與a組比較，*P<0.05。

腎臟纖維化是所有慢性腎臟病主要病理基礎(chǔ)，本研究建立經(jīng)典的大鼠UUO模型，通過單側(cè)結(jié)扎大鼠輸尿管，造成一個(gè)典型的腎間質(zhì)纖維化病理變化。異鼠李素給予干預(yù)，結(jié)果表明異鼠李素抑制UUO大鼠腎臟組織中膠原纖維的形成和α-SMA的表達(dá)，其中異鼠李素高劑量(30 mg/kg)組效果強(qiáng)于異鼠李素低劑量(10 mg/kg)組，且高、低劑量組效果均強(qiáng)于陽性藥依那普利(10 mg/kg)，提示異鼠李素可有效抑制EMT的形成和ECM的沉積，具有抗腎臟纖維化的作用。

H2S是繼一氧化氮、一氧化碳后被發(fā)現(xiàn)的第三種人體內(nèi)重要的氣體信號(hào)分子。臨床研究表明慢性腎臟病患者血清H2S水平下降[8]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明UUO大鼠的H2S水平相比于假手術(shù)組降低，H2S具有顯著的抗腎臟纖維化作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)異鼠李素可上調(diào)UUO大鼠血清H2S水平，異鼠李素對(duì)H2S相關(guān)酶表達(dá)的影響以及如何通過上調(diào)H2S具有抗腎臟纖維化的作用還需進(jìn)一步的研究。

腎小管上皮細(xì)胞在腎臟纖維化的形成中起重要作用。因此，本研究建立AngⅡ誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E細(xì)胞纖維化模型，明確異鼠李素對(duì)NRK-52細(xì)胞纖維化的影響及其機(jī)制。結(jié)果表明異鼠李素抑制腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E的增殖，抑制α-SMA的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，10～50 μmol/L濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性，提示異鼠李素抑制AngⅡ誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞EMT的形成。除此之外，異鼠李素降低TGF-β1的表達(dá)。但是異鼠李素抗腎臟纖維化作用是否通過TGF-β1/Smads信號(hào)通路或者其他途徑還需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

氧化應(yīng)激是引起腎臟纖維化的重要因素。腎臟在各種誘因(感染、損傷、化學(xué)物質(zhì)和輻射等)下引起自由基和超氧化物等的過度生成誘導(dǎo)各種細(xì)胞因子的分泌和釋放，進(jìn)而引發(fā)腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展[10]。異鼠李素是否影響氧化應(yīng)激而具有抗腎臟纖維化的作用，本研究檢測(cè)異鼠李素對(duì)ROS和超氧化物的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在異鼠李素刺激24 h時(shí)，可顯著抑制ROS的產(chǎn)生，但對(duì)超氧化物無明顯影響。表明異鼠李素可能通過抑制氧化應(yīng)激而具有抗腎臟纖維化的作用。

細(xì)胞間隙連接或稱縫隙連接，廣泛分布于多種細(xì)胞，影響細(xì)胞的代謝、繁殖、遷移和生存，在維持組織完整性中起重要的作用。Cx43蛋白是主要的間隙連接組成蛋白[11]。1989年Beyer等[12]首次在大鼠腎臟中發(fā)現(xiàn)Cx43的存在，從此開啟了Cx43與腎臟疾病的相關(guān)研究。近年來有研究證實(shí)Cx43在高血壓性腎病和梗阻性腎病的早期表達(dá)增加，抑制Cx43表達(dá)降低了炎癥細(xì)胞浸潤和腎纖維化，并明顯改善了腎臟的結(jié)構(gòu)和功能，Cx43被認(rèn)為是治療慢性腎臟病的新靶點(diǎn)[11, 13-15]。本研究中發(fā)現(xiàn)異鼠李素劑量依賴地抑制AngⅡ誘導(dǎo)的Cx43表達(dá)，表明異鼠李素抗腎臟纖維化作用很可能是通過Cx43調(diào)控。除此之外，異鼠李素對(duì)Cx43的調(diào)節(jié)作用，也提示異鼠李素很可能對(duì)Cx43介導(dǎo)的其他相關(guān)疾病也有治療作用，如心血管疾病、腫瘤、創(chuàng)傷愈合及某些生殖、消化、神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病等。

綜上所述，異鼠李素對(duì)大鼠UUO模型腎間質(zhì)纖維化及AngⅡ誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞纖維化具有保護(hù)作用，主要通過抑制EMT的形成和降低ECM的沉積。本研究發(fā)現(xiàn)異鼠李素抗腎臟纖維化作用可能與降低TGF-β1的表達(dá)，升高內(nèi)源性H2S水平和抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。異鼠李素有可能發(fā)展為潛在的抗腎臟纖維化的治療藥物。