李國峰， 陳海芳， 郎一帆， 樊慧芳， 陳春蘭， 張武崗*， 付 丹

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004；3.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330000)

黃嘌呤氧化酶(XOD)是嘌呤代謝過程中的關(guān)鍵酶，能催化黃嘌呤和次黃嘌呤氧化生成尿酸并產(chǎn)生自由基[1]。當(dāng)體內(nèi)尿酸濃度過高時(shí)，可導(dǎo)致高尿酸血癥并引起痛風(fēng)發(fā)作，同時(shí)體內(nèi)自由基的積累會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)、DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子損傷，從而誘發(fā)疾病的發(fā)生發(fā)展，如糖尿病[2]、慢性腎病[3]、心血管疾病[4]等。因此，從中藥中尋找有效調(diào)節(jié)(抑制)XOD活性的成分是當(dāng)前研究熱點(diǎn)[5]。

訶子為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz.、絨毛訶子TerminaliachebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果實(shí)[6]，可用于治療久瀉久痢、便血脫肛、肺虛喘咳、咽痛音啞等疾病，被稱為“藥物之王”，主要含有鞣質(zhì)類、多酚類、多糖類、揮發(fā)油類等[7-9]化合物，其提取物具有保肝[10]、降糖[11]、抗腫瘤[12]、抗炎[13]、解毒[14]等作用，但目前對(duì)該藥材藥理活性的研究?jī)H限于總提物，尚未涉及其總黃酮對(duì)XOD的抑制作用和抗氧化活性。因此，本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化訶子總黃酮制備工藝后，考察該成分對(duì)XOD的抑制作用和自由基的清除能力，以期為今后它在治療高尿酸血癥、痛風(fēng)中的應(yīng)用研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 訶子購自四川中庸藥業(yè)有限公司，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)楊世林教授鑒定為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz.的干燥成熟果實(shí)。蘆丁對(duì)照品(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-16031610)；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(批號(hào)C10544590)、維生素C(批號(hào)C10250787)、對(duì)氨基苯磺酸(批號(hào)C10540076)、鹽酸萘乙二胺(批號(hào)C10636097)、黃嘌呤(批號(hào)C10314543)、1,10菲羅啉(批號(hào)C10451583)、無水硫酸亞鐵(批號(hào)C10632300)(上海麥克林生化科技有限公司)；黃嘌呤氧化酶(美國Sigma公司，批號(hào)SLCB1290)。亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、30%H2O2、無水乙醇等均為分析純；蒸餾水、超純水均由江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器 GZX-9140 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；JA2003N電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；L-500低速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；HH-S恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)；116搖擺式六兩裝高速中藥粉碎機(jī)(浙江上虞市道墟寶民儀器設(shè)備廠)；酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；BUCHI Rotavapor R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(廈門精藝興業(yè)科技有限公司)。

2 方法

2.1 線性關(guān)系考察 參考文獻(xiàn)[15]報(bào)道的方法，略有改動(dòng)。精密稱取蘆丁對(duì)照品25.0 mg，置于50 mL棕色量瓶中，60%乙醇溶解定容，即得500 μg/mL對(duì)照品溶液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL至10 mL具塞試管中，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加入4%NaOH溶液5 mL，混勻，60%乙醇定容后靜置20 min，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(A)進(jìn)行回歸，得方程為A=0.008 9X-0.013 9(R2=0.999 0)，在0～60 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取500 μg/mL對(duì)照品溶液0.6 mL，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度6次，計(jì)算得RSD為0.14%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取脫脂后的干燥藥材粉末5.0 g，按“2.2”項(xiàng)下方法提取總黃酮后，于0、1、2、4、8 h按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算得RSD為1.35%，表明提取液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取脫脂后的干燥藥材粉末5.0 g，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份提取液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算得RSD為1.78%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取脫脂干燥后的總黃酮含量已知的藥材粉末6份，按80%水平加入對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備6份提取液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，計(jì)算得RSD為1.67%。

2.4 單因素試驗(yàn) 精密稱取脫脂后的干燥藥材粉末5.0 g，置于150 mL具塞錐形瓶中，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、50%、60%、70%、80%，液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1，提取時(shí)間30、60、90、120、150 min，提取溫度50、60、70、80、90 ℃對(duì)總黃酮提取率的影響。

2.5 響應(yīng)面法 以總黃酮提取率(Y)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)、提取溫度(C)、提取時(shí)間(D)為影響因素，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，平行3次，因素水平見表1。

表1 因素水平

2.6 體外生物活性研究

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 如圖1所示，總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加呈先升后降的趨勢(shì)，在60%時(shí)最高，之后出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)。因此，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響

3.1.2 液料比 如圖2所示，隨著液料比增加總黃酮提取率升高，在15∶1時(shí)最高，而大于15∶1后趨于平緩。因此，從節(jié)約成本方面考慮，確定液料比為15∶1。

圖2 液料比對(duì)總黃酮提取率的影響

3.1.3 提取溫度 如圖3所示，隨著提取溫度增加總黃酮提取率顯著升高，在70 ℃時(shí)最高，而超過70 ℃后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其原因可能為溫度過高會(huì)使對(duì)溫度敏感的成分降解為小分子，同時(shí)總黃酮結(jié)構(gòu)中的酚羥基會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)。因此，從能源、提取率方面考慮，確定提取溫度為70 ℃。

圖3 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

3.1.4 提取時(shí)間 如圖4所示，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)總黃酮提取率逐漸升高，在90 min時(shí)最高，而超過90 min后趨勢(shì)不明顯，其原因可能為提取時(shí)間越長(zhǎng)，組織細(xì)胞內(nèi)外濃度差越小，同時(shí)部分產(chǎn)物也會(huì)發(fā)生分解。因此，從能源、效率方面考慮，確定提取時(shí)間為90 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

3.2 響應(yīng)面法 采用Design-Expert 8.0.6軟件安排試驗(yàn)，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 方差分析

注：左圖為三維曲面圖，右圖為等高線圖。

通過Design-Expert 8.0.6軟件，得到最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù) 60.53%，液料比15.53∶1，提取溫度69.15 ℃，提取時(shí)間98.77 min，總黃酮提取率為5.35%，而在實(shí)際操作中將其調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)61%，液料比16∶1，提取溫度69 ℃，提取時(shí)間99 min。再進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得總黃酮平均提取率為5.28%，與預(yù)測(cè)值5.35%接近(相對(duì)誤差為1.3%)，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

3.3 體外生物活性

3.3.1 抗XOD活性 如圖6所示，總黃酮和別嘌醇對(duì)XOD均具有抑制作用，并呈顯著的劑量依賴關(guān)系，IC50為29.22 μg/mL，約為別嘌呤醇的1/22(1.369 μg/mL)。

圖6 總黃酮對(duì)XOD的抑制率

3.3.2 抗氧化活性

3.3.2.1 清除DPPH自由基 如圖7所示，總黃酮具有良好的DPPH自由基清除活性，并呈顯著的劑量依賴關(guān)系，IC50為0.127 7 mg/mL，接近維生素C(0.101 6 mg/mL)。

圖7 總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率

3.3.2.2 清除羥自由基 如圖8所示，總黃酮具有良好的羥自由基清除活性，并呈顯著的劑量依賴關(guān)系，IC50為0.518 8 mg/mL，接近維生素C(0.272 8 mg/mL)。

圖8 總黃酮對(duì)羥自由基的清除率

3.3.2.3 清除亞硝酸根離子 如圖9所示，隨著總黃酮質(zhì)量濃度增加，它對(duì)亞硝酸根離子的清除率明顯升高，在200 μg/mL時(shí)最高，并在一定范圍內(nèi)呈量效關(guān)系，IC50為42.78 μg/mL，略低于維生素C(11.12 μg/mL)。

圖9 總黃酮對(duì)亞硝酸根離子的清除率

4 討論

于姝燕等[20]采用基于正交設(shè)計(jì)的微波輔助提取技術(shù)來優(yōu)化訶子總黃酮的提取工藝，但由于微波萃取設(shè)備存在微波泄露的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致應(yīng)用受限，而且未對(duì)所提取總黃酮的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。因此，本實(shí)驗(yàn)基于回流提取方式，選擇響應(yīng)面分析法用于優(yōu)化訶子總黃酮提取工藝參數(shù)，該方法在中藥有效成分的提取分離領(lǐng)域中已有廣泛應(yīng)用[21-22]，相比于正交試驗(yàn)或均勻試驗(yàn)，它具有試驗(yàn)次數(shù)少、周期短、精度好、預(yù)測(cè)性強(qiáng)、能研究幾種因素之間的交互作用、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)[23]。

體外活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在3.75～150 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，訶子總黃酮對(duì)XOD的抑制作用呈劑量依賴關(guān)系，IC50為 29.22 μg/mL，表明該成分具有體外抗XOD活性，可為尋找相關(guān)天然抑制劑提供依據(jù)。此外，訶子總黃酮還顯示出很強(qiáng)的DPPH自由基清除能力(接近于維生素C)及較好的清除羥自由基、亞硝酸根離子能力，其中亞硝酸根(NO2-)是生成N-二甲基亞硝胺(NDMA)的前體，而NDMA具有較強(qiáng)的致突變和致癌性, 對(duì)人體健康會(huì)產(chǎn)生潛在的危害。因此，后期可將訶子作為潛在的預(yù)防高尿酸血癥藥物和抗氧化劑進(jìn)行深入研究。