劉 佳， 郭文潔， 耿 驥， 談德斐， 湯新慧， 高 靜*

（1.江蘇大學藥學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.鹽城師范學院江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護重點建設實驗室，江蘇鹽城224051）

異鼠李素誘導HCT116細胞自噬

劉 佳1，2， 郭文潔1， 耿 驥1， 談德斐1， 湯新慧2*， 高 靜1*

（1.江蘇大學藥學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.鹽城師范學院江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護重點建設實驗室，江蘇鹽城224051）

目的 研究中華補血草［Limonium sinense（Girard）Kuntz］中主要抗癌活性成分之一異鼠李素誘導人結直腸癌（HCT116）細胞自噬的機理。方法 采用四唑鹽比色法 （MTT）檢測異鼠李素對HCT116細胞的抑制作用，單丹尸磺酰胺（MDC）染色法檢測自噬小泡的形成，蛋白印跡法（Western blot）檢測自噬相關蛋白LC3的表達情況。結果

中華補血草；異鼠李素；HCT116細胞；細胞自噬

中華補血草［Limonium sinense（Girard）Kuntz］是藍雪科補血草屬植物，為多年泌鹽草本植物，具有耐鹽、耐瘠、耐旱、耐濕等特點，廣泛分布于我國東北、華北等地區(qū)，尤以江蘇、浙江、福建省沿海灘涂分布甚廣［1］。該植物適應性強，人工栽培產(chǎn)量高［2］。中華補血草是一種傳統(tǒng)的中草藥，具有清熱解毒、止血散瘀、祛風消炎、抗癌等作用［3］，它的活性成分主要包括異鼠李素、甘

露醇、β-谷甾醇、齊墩果酸、槲皮素、沒食子酸乙酯、山柰酚等［4-5］。

異鼠李素（isorhamnetin），也稱3，5，7-三羥基-2-（4-羥基-3-甲氧基苯基）苯并吡喃-4-酮，是一種黃酮類化合物，存在于多種植物中，是中華補血草中主要單體之一［6］。已有研究表明，異鼠李素具有清除氧自由基、擴張血管降血壓、降低血膽固醇、防止冠狀動脈粥樣硬化等作用［7］。另外，異鼠李素還具有顯著的抗腫瘤作用，可抑制如胃癌、肺癌、肝癌等細胞的生長［8-9］。目前，有關異鼠李素抗腫瘤作用的機理研究主要集中在其抑制細胞增殖、誘導凋亡方面［10-12］，而細胞的死亡方式不僅有凋亡，作為細胞發(fā)生死亡的另一種機制—自噬，在抗腫瘤的研究中日漸引起廣泛注意［13］。因此，本實驗從抑制腫瘤細胞生長，誘導細胞自噬方面對異鼠李素抑制HCT116細胞的作用進行了研究。

1 材料與儀器

DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）；MTT、胰酶 （美國Amresco公司）；MDC（美國Sigma公司）；LC3抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；中華補血草，采自江蘇省鹽城灘涂，由鹽城師范學院于延球副教授鑒定。

HealForce CO2孵箱；TS100 Nikon倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；Spectra Max 190酶標儀（美國Molecular Device公司）；Nikon eclipse Ti-E熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；Mini-PROTEIN電泳系統(tǒng)（美國Biorad公司）。

2 方法

2.1 異鼠李素提取與分離方法 中華補血草根3.6 kg，粉碎，用95%乙醇回流提取3次，濾過，合并濾液，減壓濃縮回收溶劑，得粗浸膏，加水依次用等體積石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取濃縮物3次，回收溶劑得各部分萃取物，分別合并萃取物，得到5個萃取部位，分別為：石油醚部位（LSPF）62.7 g，氯仿部位（LSCF）40.6 g，乙酸乙酯部位（LSEF）58.2 g，正丁醇部位（LSBF）81.3 g和水部位（LSWF）93.4 g。取氯仿部位和乙酸乙酯部位，利用凝膠柱色譜、制備薄層色譜、ODS柱色譜、Sephadex LH-20進一步純化，從氯仿部位得到化合物1（30.7 mg）、2（16.8 mg）、3（24.1 mg）、4（56.8 mg）、5（46.2 mg）；從乙酸乙酯部位得到化合物6（103.4 mg）、7（22.6 mg）、8（206.0 mg）、9（31.9 mg）、10（93.4 mg）、11（9.7 mg）、12（32.7 mg）、13（45.3 mg）、14（21.7 mg）。經(jīng)過抗腫瘤活性篩選，取活性較好的化合物1、4、5、6、8、10，經(jīng)結構鑒定分別為異鼠李素 （純度≥95%）、齊墩果酸、烏蘇酸、槲皮素、沒食子酸、木犀草素。

2.2 細胞培養(yǎng) 人腫瘤細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 MTT法檢測細胞活性 取對數(shù)生長期細胞，以4×104個/m L的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL。以不同劑量的化合物處理細胞48 h后，去上清，每孔加入100μLMTT（1 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入100μL二甲基亞砜，振蕩混勻，用酶標儀在570 nm處測定吸光度值（D）值，每組5個復孔，實驗重復3次。計算抑制率，公式：抑制率（%）=（1-給藥組吸光度值/對照組吸光度值）×100%。

2.4 MDC染色檢測自噬小泡的形成 取對數(shù)生長期的HCT116細胞，以4×104個/m L的密度接種于24孔板中，每孔500μL，以一定劑量的化合物處理細胞后，加入50μmol/L MDC染液300 μL避光孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察自噬小泡的產(chǎn)生。

2.5 Western blot檢測LC3蛋白的表達 收集細胞，離心，PBS洗兩次，加入一定量的細胞裂解液，置冰上裂解30 min，12 000×g離心5 min，吸上清。用BCA（bicinchonininc acid）蛋白定量法進行定量，其余樣品按比例加入6×SDS凝膠上樣緩沖液溶解，煮沸5 min。取20μg蛋白樣品進行15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；在300 mA恒流的條件下、將蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜 （PVDF）上；將膜置于封閉液中封閉2 h；一抗孵育4℃過夜；之后用磷酸鹽吐溫緩沖液 （PBST）清洗；二抗室溫孵育2 h；再用PBST清洗；ECL發(fā)光液檢測目的條帶。

3 結果

3.1 異鼠李素抑制HCT116細胞的增殖 將不同劑量的異鼠李素作用于3種腫瘤細胞株 （HCT116、Hela、HepG2），48 h后檢測細胞活性，計算IC50。從表1可以看出，異鼠李素對不同腫瘤細胞作用效果不同，對HCT116細胞的效果最為明顯，如圖1所示，隨著劑量的增加，異鼠李素對HCT116細胞的抑制率也有所增加。用倒置相差顯微鏡觀察細胞的生長情況 （圖2），與空白組相比，異鼠李素處

理組隨著劑量的增加，細胞的形態(tài)學發(fā)生明顯改變，細胞數(shù)目減少。

表1 異鼠李素作用48 h抑制不同腫瘤細胞增殖的IC50值Tab.1 IC50of isohamnetin on different tumor cell lines for 48 h

圖1 異鼠李素劑量依賴性抑制HCT116細胞增殖 （ˉx± s，n=5）Fig.1 Dose-dependent effect of isorhamnetin on cell proliferation of HCT116 cells（ˉ，n=5）

圖2 異鼠李素誘導HCT116細胞損傷的形態(tài)學觀察（×200）Fig.2 M orphological changes of HCT116 cellswere induced by isorphamnetin（×200）

3.2 異鼠李素誘導自噬小泡的形成 MDC染色結果表明，10、30、100μmol/L異鼠李素作用于HCT116細胞24 h，隨著劑量的增大細胞內(nèi)點狀熒光增多，熒光強度增加，即自噬小泡顯著增多，如圖3所示。

3.3 異鼠李素誘導LC3蛋白表達增加 為了進一

圖3 異鼠李素誘導自噬小泡形成 （M DC染色，×200）Fig.3 Formation of autophagosomes was induced by isorhamnetin（×200）

步驗證異鼠李素誘導HCT116細胞發(fā)生自噬，我們還對其自噬標志性的蛋白LC3的表達情況進行了檢測。如圖4所示，以不同劑量 （0、10、30、100 μmol/L）的異鼠李素處理細胞24 h，能增加細胞內(nèi)LC3總蛋白的量以及活性形式LC3-Ⅱ的表達，且在30μmol/L時最為顯著。以上結果均說明，異鼠李素可劑量依賴性誘導HCT116細胞發(fā)生自噬。

圖4 異鼠李素劑量依賴性誘導LC3表達增加Fig.4 Dose-dependent effect of isorhamnetin on the expression of protein LC3

3.4 3-MA降低異鼠李素對HCT116的抑制作用

為了檢測本實驗中異鼠李素誘導的自噬在細胞死亡過程中發(fā)揮的作用，我們使用3-MA（自噬阻斷劑）預處理細胞，結果如圖5所示，當自噬被阻斷后，異鼠李素對細胞的抑制率明顯降低，表明本實驗中異鼠李素誘導的自噬是導致細胞死亡的一種方式。

4 討論

圖5 3-甲基腺嘌呤降低異鼠李素對HCT116細胞的抑制率（n=5）Fig.5 3-MA induces the inhibition rate of isorhamnetin in HCT116 cells（n=5）

本研究采用MTT法、細胞形態(tài)學觀察等方法考察了異鼠李素對結腸癌細胞HCT116體外生長的影響。結果表明，異鼠李素可以劑量依賴性抑制HCT116的生長。從本實驗結果可以看出異鼠李素處理過的細胞，出現(xiàn)自噬的特征性變化，隨著異鼠李素劑量的增加，自噬小泡增多，自噬標志性蛋白LC3的總量及其活化形式LC3-II表達增多。自噬抑制劑3-MA預處理后能夠明顯降低異鼠李素對細胞的抑制作用。因此，我們推測異鼠李素的抗腫瘤活性除了通過抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡外，誘導細胞自噬在此過程中也起著重要作用。異鼠李素誘導自噬的發(fā)生的信號通路則需進一步的研究。綜上所述，中華補血草活性成分異鼠李素對腫瘤有一定的調(diào)節(jié)作用，將來可被開發(fā)用于腫瘤治療。

［1］ 郭巧生，蘇筱娟.江蘇省沿海灘涂野生藥用植物生物多樣性及其保護［J］.中國野生植物資源，1999，18（3）：28-30.

［2］ 董必慧.江蘇沿海灘涂中華補血草的保護性研究［J］.中國野生植物資源，2005，24（6）：28-30.

［3］ 張華彬，張代臻，葛寶明，等.中華補血草的生藥學研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22（12）：2847-2848.

［4］ 劉興寬.中華補血草的化學成分研究［J］.中草藥，2011，42（2）：230-233.

［5］ 李 均，陳炳華，蘇安玲.中華補血草根提取物抗氧化活性的初步研究［J］.福建師范大學學報，2008，24（3）：83-86.

［6］ 胡 珊，鄧甬川.異鼠李素對乳腺癌細胞的作用機制［J］.中國藥科大學學報，2013，44（6）：563-567.

［7］ Sun J，Sun G，Meng X，et al，Isorhamnetin protects against doxorubicin-induced cardiotoxicity in vivo and in vitro［J］.PLoS 0ne，2013，8（5）：e64526.

［8］ 李 垚，王鵬祖，張慧穎.異鼠李素對人胃癌細胞生長的抑制作用［J］.中國初級衛(wèi)生保健，2008，22（6）：58-59.

［9］ Li C，Yang X，Chen C，et al，Isorhamnetin suppresses colon cancer cell growth through the PI3K-Akt-mTOR pathway［J］. Mol Med Rep，2014，9（3）：935-940.

［10］ 左愛仁，汪滿紅，萬春鵬，等.東方肉穗草異鼠李素誘導HepG2細胞凋亡研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22（2）：427-428.

［11］ 蔣晨春，向 義，鐘 勇.異鼠李素對人肝癌HepG2細胞增殖與凋亡影響的實驗研究［J］.西南軍醫(yī)，2012，14（3）：432-435.

［12］ 李 炯，王 剛，杜士明，等.異鼠李素抗腫瘤的作用及機制研究進展［J］.山西醫(yī)藥雜志，2011，40（12）：1215-1217.

［13］ 王 寵，張 萍，朱衛(wèi)國.細胞自噬與腫瘤發(fā)生的關系［J］.中國生物化學與分子生物學報，2010，26（11）：988-997.

Isorhamnetin induces autophagy in HCT116 cells

LIU Jia1，2， GUOWen-jie1， GEN Ji1， TAN De-fei1， TANG Xin-hui2*， GAO Jing1*

（1.School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang 212O13，China；2.Jiangsu Provincial Key Laboratory of CoastalWetland Bioresourcesand Environmental Protection，Yancheng Normal University，Yancheng 224O51，China）

AIM To investigate the mechanism for the isorhamnetin-induced autophagy of human colon carcinoma cell line HTC116，which was one of the anticancer constituents from Limonium sinense（Girard）Kuntze. METHODS （MTT）assay was performed on the inhibitory effectof isorhamnetin againstHCT116 cells；the formation of autophagic vacuoles and the expression of autophagy-related protein LC3 were assessed bymonodansylcadervarine（MDC）staining and Western blot，respectively.RESULTS Isorhamnetin obviously exhibited the inhibition on HCT116 cells proliferation in a dose-dependentmanner.After being treated with isorhamnetin for 24 hours，both the fluorescence intensity ofMDC and the expression of protein LC3 were significantly enhanced.Furthermore，the inhibitory effect of isorhamnetin against HCT116 cells was weakened as these cells were pretreated with 3-methyladenine（3-MA）.CONCLUSION Isorhamnetin can induce the autophagic cell death in HCT116.

Limonium sinense（Girard）Kuntze；isorhamnetin；human colon carcinoma cell line（HCT116 cells）；autophagy

R285.5

A

1001-1528（2015）12-2596-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.005

2014-10-23

國家自然科學基金資助項目 （81102817）

劉 佳（1990—），女，碩士生，主要從事生藥藥理研究。Tel：18361811921，E-mail：average97@126.com

*通信作者：湯新慧（1966—），女，教授，博士，主要從事藥理學研究。E-mail：xinhuitang@sina.com高 靜（1966—），女，教授，博士，博士生導師，主要從事藥理學研究。E-mail：jinggao@ujs.edu.cn

異鼠李素明顯抑制HCT116細胞的增殖，且呈劑量依賴性效應。異鼠李素處理24 h后，自噬小泡形成增多，LC3蛋白表達增強。3-甲基腺嘌呤 （3-MA）預處理能夠明顯降低異鼠李素對腫瘤細胞的抑制作用。結論 實驗結果顯示中華補血草中的異鼠李素可以誘導HCT116細胞發(fā)生自噬，導致細胞死亡。