黃海潮， 聶 陽， 張小紅， 朱慶玲， 巫 瑋， 周 捷

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，廣東 廣州510520；2.中山大學(xué)腫瘤防治中心藥學(xué)部，廣東廣州510060）

甘木通總黃酮保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷

黃海潮1， 聶 陽1， 張小紅1， 朱慶玲1， 巫 瑋1， 周 捷2

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，廣東 廣州510520；2.中山大學(xué)腫瘤防治中心藥學(xué)部，廣東廣州510060）

目的 探討甘木通（Clematis filamentosa）總黃酮（TFC）對(duì)H2O2引起的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12細(xì)胞）損傷的保護(hù)作用。方法 用H2O2損傷PC12細(xì)胞建立神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷模型，噻唑藍(lán) （MTT）法檢測(cè)細(xì)胞存活率，觀察甘木通總黃酮對(duì)神經(jīng)元損傷的作用；形態(tài)學(xué)以及Hoechst 33258染色觀察TFC對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響；生化法測(cè)定超氧化物歧化酶 （SOD）活性以及丙二醛 （MDA）的量。結(jié)果 與200μmol/L H2O2誘導(dǎo)的模型組對(duì)比，中 （10 μg/mL）、高 （100μg/mL）劑量甘木通總黃酮預(yù)處理細(xì)胞形態(tài)好于模型組，細(xì)胞活性明顯增強(qiáng) （P＜0.05），細(xì)胞內(nèi)的SOD活性增強(qiáng) （P＜0.05），MDA水平減低 （P＜0.05）。結(jié)論 甘木通總黃酮對(duì)H2O2引起的神經(jīng)損傷有保護(hù)作用。

甘木通；總黃酮；PC12細(xì)胞；SOD；MDA

腦中風(fēng)是一組以腦部缺血及出血性損傷癥狀為主要臨床表現(xiàn)的疾病，又稱腦卒中或腦血管意外。其病因是由于腦血流供應(yīng)障礙引起缺血和缺氧而導(dǎo)致局限性腦組織缺血性壞死或腦軟化的疾?。?］。自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化被認(rèn)為是腦缺血及缺血后再灌注損傷的主要機(jī)制之一，使用H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，模擬氧化應(yīng)激水平的升高對(duì)神經(jīng)元的毒性作用是目前研究腦缺血中風(fēng)的主要細(xì)胞模型［2］。

甘木通為毛茛科絲鐵線蓮（Clematis filamentosa Dunn）的葉，民間俗稱為 “眼蛇藥”，有活血通脈降壓、鎮(zhèn)靜安神之功效。據(jù) 《全國中草藥匯編》記載，甘木通對(duì)腦血管意外引起的中風(fēng)偏癱患者均有治療作用。目前，對(duì)于甘木通研究集中在

心血管系統(tǒng)方面［3］，其在神經(jīng)系統(tǒng)尤其在腦中風(fēng)中的作用還未見相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。課題組通過提取分離甘木通總黃酮（total flavones from Clematis filamentosa，TFC），運(yùn)用形態(tài)和功能與神經(jīng)元相似的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞 （PC12細(xì)胞）研究其神經(jīng)保護(hù)作用，豐富其藥物治療的理論，便于其深入開發(fā)研究。

1 儀器與材料

1.1 細(xì)胞與試劑 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12細(xì)胞）（購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞研究所）；甘木通藥材 （購于廣東康美藥業(yè)中藥飲片廠）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、24孔板、96孔板 （美國Corning公司）；DMEM培養(yǎng)基，馬血清（美國Gibco公司）；胎牛血清 （FBS）（杭州四季青公司）；胰蛋白酶（美國Amresco公司分裝）；Triton X-100、噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司）；磷酸緩沖液 （PBS）（pH 7.2）（杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 水平離心機(jī) （湘儀離心機(jī)廠）；熒光倒置顯微鏡（德國Leica公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、二級(jí)生物安全柜 （美國Thermo公司）；酶標(biāo)儀（美國BIO-TEK公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘木通總黃酮的制備 甘木通藥材干燥后，粉碎備用，根據(jù)文獻(xiàn)［4］采用表面活性劑-超聲協(xié)同提取，甘木通總黃酮得率為1.06%。所得總黃酮用DMEM培養(yǎng)基超聲溶解，無菌過濾備用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將PC12細(xì)胞接種于含有5%FBS和5%馬血清、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL硫酸鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、飽和濕度、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換液一次，細(xì)胞接種第3天，用0.25%的胰酶消化傳代。細(xì)胞傳代至第4代，取對(duì)數(shù)生長期PC12細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至4×104個(gè)/mL單細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μL單細(xì)胞懸液，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，更換成無血清DMEM培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)待用。

2.3 甘木通總黃酮對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響 取實(shí)驗(yàn)待用細(xì)胞，于每孔加入不同質(zhì)量濃度的甘木通總黃酮，使其最終分別為0、0.1、1、10、100、1 000μg/mL。并設(shè)空白調(diào)零孔（只加DMEM培養(yǎng)基，不加細(xì)胞）。每組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，每孔加入5 mg/mLMTT 10μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入DMSO 100μL，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在490 nm波長下的吸光度 （D）值。通過吸光度值高低反映細(xì)胞的活力。細(xì)胞活性計(jì)算如下：細(xì)胞活性（%）=D藥物組/D空白細(xì)胞組×100%

2.4 H2O2對(duì)PC12細(xì)胞的作用 取實(shí)驗(yàn)待用細(xì)胞，于每孔加入不同量的H2O2，使其終質(zhì)量濃度分別為0、50、100、200、400、800μg/mL。每組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)12 h，每孔加入5 mg/mL MTT 10μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入DMSO 100μL，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在490 nm波長下的吸光度 （D）值。

2.5 不同質(zhì)量濃度TFC對(duì)H2O2引起PC12細(xì)胞損傷的影響 取 “2.2”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)待用細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組為空白細(xì)胞組，H2O2損傷組（200μmol/L H2O2），并參照相關(guān)文獻(xiàn)［5］設(shè)置陽性對(duì)照組 ［200μmol/L H2O2+200μmol/L維生素E（VE）］，低（200μmol/ L H2O2+1μg/mL TFC）、中（200μmol/L H2O2+ 10μg/mL TFC）、高劑量保護(hù)組（200μmol/L H2O2+100μg/mL TFC），TFC先加入PC12細(xì)胞中預(yù)保護(hù)24 h，再加入終濃度為200μmol/L的H2O2作用12 h，用MTT法觀察TFC對(duì)H2O2引起PC12細(xì)胞損傷的影響。

2.6 TFC對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)的影響 取實(shí)驗(yàn)待用細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分成空白細(xì)胞組、H2O2損傷組（200μmol/L H2O2）、TFC預(yù)保護(hù)組（200μmol/L H2O2+100μg/mL TFC）、陽性對(duì)照組（200μmol/L H2O2+200μmol/L VE）。先加入藥物預(yù)處理12 h，再加入終濃度為200μmol/L的H2O2作用12 h后，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。再加入4%的多聚甲醛固定，用10μg/mL的Hoechst33258對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色10 min后，用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.7 甘木通總黃酮對(duì)PC12細(xì)胞中SOD、MDA量的影響［6］實(shí)驗(yàn)分組為空白細(xì)胞組，H2O2損傷組（200μmol/L H2O2），低（200μmol/L H2O2+ 1μg/mL TFC）、中（200μmol/LH2O2+10μg/mL TFC）、高劑量保護(hù)組（200μmol/L H2O2+100 μg/mL TFC）。細(xì)胞接種于24孔板，先加入TFC預(yù)處理12 h，再加入終濃度為200μmol/L的H2O2作用12 h后，去除原培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，每孔加入0.1 mol/L的PBS和0.05 mmol/m L的EDTA（pH 8.0）1 m L，再加入50μL 1%的Triton X-100，將培養(yǎng)板置振蕩器振蕩1 min使之溶解，加

入25%的H3PO4100μL，12 000 r/mim于4℃離心1 h，取上清液，按說明書測(cè)定 SOD活性和MDA水平。

3 結(jié)果

3.1 不同質(zhì)量濃度TFC對(duì)PC12細(xì)胞活性的影響

結(jié)果所示在0～100μg/mL范圍內(nèi)，TFC對(duì)細(xì)胞的活性沒有明顯影響 （P＞0.05），當(dāng)達(dá)到1 000μg/mL時(shí)，TFC對(duì)細(xì)胞的活性下降較明顯（P＜0.05）；因此，后面的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不超過100μg/mL。結(jié)果如圖1所示。

圖1 甘木通總黃酮對(duì)PC12細(xì)胞活性影響 （，n=5）Fig.1 Effects of TFC on cell viability in PC12（，n= 5）

3.2 H2O2對(duì)PC12的損傷作用 H2O2對(duì)PC12細(xì)胞的抑制作用明顯，在H2O2達(dá)到50μmol/L時(shí)，細(xì)胞增值率明顯下降 （P＜0.05），隨著濃度的加大，細(xì)胞活性降低明顯，當(dāng)超過400μmol/L時(shí)，抑制趨緩，表明在該濃度下，接近最大抑制濃度。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，參考對(duì)比相關(guān)文獻(xiàn)［5-8］，選擇H2O2損傷PC12細(xì)胞的濃度為200μmol/L，見圖2。

3.3 TFC對(duì)H2O2引起PC12細(xì)胞氧化損傷的作用H2O2明顯抑制PC12細(xì)胞的活性，在低劑量TFC預(yù)保護(hù)下，H2O2對(duì)細(xì)胞的損傷程度減輕，但作用不明顯（P＞0.05），在中高劑量TFC下，TFC的保護(hù)作用明顯，細(xì)胞損傷程度明顯減少 （P＜0.05）。陽性對(duì)照組對(duì)H2O2引起的細(xì)胞損傷同樣具有保護(hù)作用。結(jié)果見圖3。

圖2 H2O2對(duì)損傷PC12細(xì)胞活性影響（，n=5）Fig.2 Effects of H2O2on cell viability in PC12（，n=5）

圖3 甘木通總黃酮對(duì)H2O2損傷PC12細(xì)胞活性的影響（，n=5）Fig.3 Effects of TFC on PC12 cells viability injured by H2O2（，n=5）

3.4 TFC對(duì)H2O2損傷PC12細(xì)胞形態(tài)的影響 分別用倒置顯微鏡和熒光顯微鏡觀察，空白細(xì)胞組呈不規(guī)則多角形，Hoechst染色顯示空白細(xì)胞組中的PC12細(xì)胞核呈暗藍(lán)色；在H2O2誘導(dǎo)下，細(xì)胞輪廓變得模糊，Hoechst結(jié)果顯示，亮藍(lán)色增多明顯，表明細(xì)胞碎片增多；陽性對(duì)照組與TFC預(yù)保護(hù)組顯示細(xì)胞形態(tài)較損傷組完好，細(xì)胞貼壁生長明顯增多，細(xì)胞形態(tài)部分恢復(fù)；Hoechst結(jié)果顯示細(xì)胞碎片較損傷組減少，結(jié)果顯示TFC能減輕H2O2引起PC12細(xì)胞凋亡的損傷作用。結(jié)果見圖4。

3.5 TFC對(duì)SOD活性以及MDA水平的影響 與空白細(xì)胞組對(duì)比，H2O2損傷組明顯減少SOD的活性，MDA水平明顯增加。TFC預(yù)保護(hù)組中，低劑量組與模型組沒有明顯的區(qū)別 （P＞0.05），中、高劑量組與模型組對(duì)比，SOD活性增加明顯，MDA水平降低。結(jié)果見表1。

圖4 甘木通總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷形態(tài)影響Fig.4 Effects of TFC on H2O2-injured PC12 cellsmorphology

表1 TFC對(duì)H2O2損傷PC12細(xì)胞SOD活性和M DA水平的影響 （，n=3）Tab.1 E ffects of TFC pretreatment on activity of SOD and level of MDA in H2O2-injured PC12 cells（，n=3）

表1 TFC對(duì)H2O2損傷PC12細(xì)胞SOD活性和M DA水平的影響 （，n=3）Tab.1 E ffects of TFC pretreatment on activity of SOD and level of MDA in H2O2-injured PC12 cells（，n=3）

注：與空白細(xì)胞組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 劑量/（μg·m L-1）MDA/（nmol·L-1）SOD/（U·m L-1）- 3.24±0.12 1.76±0.08模型組（H2O2） - 5.15±0.11*0.80±0.08*甘木通總黃酮低劑量組 1 4.96±0.15 0.88±0.06甘木通總黃酮中劑量組 10 4.44±0.19#*1.02±0.09#*甘木通總黃酮高劑量組 100 4.20±0.13#*1.23±0.11#*空白細(xì)胞組

4 討論

氧化應(yīng)激（oxidative stress）是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生與抗氧化之間失衡，從而導(dǎo)致ROS在體內(nèi)蓄積，并引起一系列生物反應(yīng)的過程［9］。正常腦組織中含高水平的不飽和脂肪酸、兒茶酚胺和高水平的氧化代謝，是最易受氧自由基侵襲的靶器官，加上腦組織清除自由基的能力較差，對(duì)活性氧引起的損傷更加敏感［10］；因此，氧化應(yīng)激等非傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因素已成為缺血性卒中（ischemic stroke，IS）研究的焦點(diǎn)［11］。MDA是神經(jīng)元脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，SOD是神經(jīng)元內(nèi)存在抗氧化系統(tǒng)中重要的生物酶，MDA水平以及SOD活性可以評(píng)價(jià)神經(jīng)損傷的程度。Hoechst 33258常用于檢測(cè)細(xì)胞核完整性。正常的細(xì)胞核在染料作用下顏色暗淡藍(lán)色；在細(xì)胞損傷的情況下，細(xì)胞核形態(tài)改變甚至皺縮破裂，表現(xiàn)出核質(zhì)聚集，并呈現(xiàn)典型的橢圓狀的顏色透亮凋亡核小體。Hoechst 33258染色可以通過藍(lán)色熒光的強(qiáng)弱以及核小體的大小、形態(tài)反映細(xì)胞的完整性以及凋亡損傷情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞12 h，細(xì)胞皺縮明顯，碎片增多，Hoechst 33258核染顯示，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，透亮的核小體大量出現(xiàn)，MTT結(jié)果顯示細(xì)胞活性降低明顯，SOD活性降低，MDA水平升高，表明H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的細(xì)胞氧化應(yīng)激模型成功。中、高劑量TFC預(yù)保護(hù)能明顯減少細(xì)胞損傷中核小體的出現(xiàn)，減少細(xì)胞凋亡的出現(xiàn)并使細(xì)胞恢復(fù)正常的形態(tài)；MTT結(jié)果顯示，TFC具有明顯保護(hù)H2O2引起的細(xì)胞損傷；SOD以及MDA結(jié)果表明TFC能降低H2O2對(duì)神經(jīng)元造成的氧化應(yīng)激的損害，提示TFC對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用與提高SOD活性，降低MDA水平有關(guān)。

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Neuroprotective effects of total flavones from Clematis filamentosa against H2O2-induced injury to PC12 cells

HUANG Hai-chao1， NIE Yang1， ZHANG Xiao-hong1， ZHU Qing-ling1， WUWei1， ZHOU Jie2

（1.Experiment Center of Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou 51O52O，China；2.Departmentof Pharmacy，SUN YAT-SENUniversity Cancer Center，Guangzhou 51OO6O，China）

AIM To study neuroprotective effects of total flavones from Clematis filamentosa（TFC）on H2O2-induced injury to rat pheochromocytoma cells（PC12 cells）.M ETHODS The viability of PC12 cells injured by H2O2was determined by MTT assay.The cellularmorphology was observed by Hoechst33258 staining to evaluate protective effects of TFC on the injured cells.The SOD viability and MDA levels were detected by biochemical methods.RESULTS Compared with the model group，cell viability and SOD activity of TFC pretreated groups（10μg/mL，100μg/mL）were higher（P＜0.05）and the MDA levelwas lower（P＜0.05）obviously.

Clematis filamentosa；total flavone；rat pheochromocytoma cells（PC12 cells）；SOD；MDA

R285.5

A

1001-1528（2015）12-2585-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.003

2015-05-26

廣東省中醫(yī)藥局中醫(yī)藥強(qiáng)省項(xiàng)目 （20141197）；廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金項(xiàng)目 （B2013071）；廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院自然科學(xué)項(xiàng)目 （2012YZ007）

黃海潮（1982—），男，碩士，實(shí)驗(yàn)師，從事活性物質(zhì)篩選研究。Tel：（020）28854990，E-mail：huanghac@gdyzy.edu.cn

CONCLUSION TFC shows neuroprotective effects on PC12 cells injured by H2O2.