賈 靜 劉洪臣 劉雪梅 章捍東

海馬是神經(jīng)系統(tǒng)的高級核團(tuán)，邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為海馬的功能與記憶、情緒等反應(yīng)有關(guān)[1,2]，而對于海馬的其它功能卻知之甚少。近年來的一些研究顯示海馬可能在疼痛的調(diào)節(jié)中起作用。以往對咬合創(chuàng)傷的研究顯示，咬合創(chuàng)傷后能引起初級感覺中樞內(nèi)SP、NMDAR、PPTA以及膠質(zhì)細(xì)胞的改變[3-5]，但對于海馬的結(jié)構(gòu)和功能影響卻未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立咬合創(chuàng)傷動物模型，觀察大鼠咬合創(chuàng)傷后海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化，了解海馬結(jié)構(gòu)是否參與了咬合創(chuàng)傷的反應(yīng)及調(diào)節(jié)。

1.材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選用健康雄性SD大鼠35只，體重280-320g，鼠齡10-12w。將其平均分為7組，一組作為對照，其余六組分別為咬合創(chuàng)傷1d、3d、7d、2w、4w、5w組。所有大鼠自由飲水，喂食硬質(zhì)鼠料，于動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 咬合創(chuàng)傷動物模型的建立 10%水合氯醛麻醉大鼠，于左側(cè)上頜第一磨牙面粘結(jié)方絲，抬高咬合0.5mm,形成左側(cè)磨牙早接觸的創(chuàng)傷咬合，待粘結(jié)劑徹底干燥后，將動物放回正常飼養(yǎng)。各組動物到達(dá)預(yù)定時(shí)間點(diǎn)后，以100g/L水合氯醛腹腔深度麻醉后開胸，經(jīng)升主動脈插管，先以生理鹽水100ml沖洗血液，繼以含40g/L多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)500ml灌流2h，注畢立即取全腦置于200g/L蔗糖溶液(4℃)浸泡，直至完全沉底。連續(xù)冰凍冠狀切片，片厚10μm，置于0.01mol/L的PBS中。

1.3 免疫熒光染色 切片在0.1mol/L PBS中漂洗后，入含0.5%Triton X-100的0.1mol/L PBS中浸泡30min(室溫)，然后入兔抗GFAP抗體稀釋液(1∶100)，4℃冰箱過夜后，0.1mol/L PBS振洗30分鐘，入TRITC-IgG室溫孵育2小時(shí)，0.1mol/L PBS振洗后Moviol封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察，采集圖像。

1.4 圖像采集及分析 激光共聚焦顯微鏡下采集免疫熒光染色圖像，每張切片選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)。對各實(shí)驗(yàn)組與對照組的比較采用方差分析，統(tǒng)計(jì)過程采用Stata7.0軟件進(jìn)行。

2.結(jié)果

正常大鼠海馬區(qū)平均GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)為42.2±6.54，7d組GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量開始增加，2w組GFAP陽性細(xì)胞數(shù)繼續(xù)上升，4w組達(dá)高峰，主要分布在CA1區(qū)及CA3區(qū)，但以CA3區(qū)為主，5w時(shí)陽性細(xì)胞數(shù)開始下降，與2w組陽性率接近(圖1-3,附表)。

附表 咬合創(chuàng)傷后大鼠海馬CA3區(qū)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/mm2)

3.討論

海馬是邊緣系統(tǒng)中的重要結(jié)構(gòu)，與其它腦區(qū)有著廣泛的纖維聯(lián)系。是調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)、記憶、行為、情緒反應(yīng)的重要神經(jīng)解剖學(xué)基礎(chǔ)。同時(shí)在應(yīng)激調(diào)控中也起著非常重要的作用。近年來的研究顯示，海馬可能參與痛感覺反應(yīng)和痛調(diào)控。給予致痛強(qiáng)度熱刺激，可引起海馬局部血流發(fā)生改變；在海馬齒狀回局部注射利多卡因，可以減輕由熱刺激引起的疼痛，而注射IL-2或刺激海馬背部可提高痛閾[6]。提示海馬參與了傷害性刺激的過程。

海馬在痛覺調(diào)控中的作用研究較少，集中在海馬神經(jīng)元對疼痛刺激的反應(yīng)上。動物模型顯示，來自不同區(qū)域的傷害性刺激可引起海馬不同區(qū)域的不同變化。Khanna等發(fā)現(xiàn)足底注射福爾馬林可以誘導(dǎo)海馬CA1區(qū)c-fos的表達(dá)增加[7,8]。同時(shí)海馬CA3、CA4區(qū)PKC免疫陽性細(xì)胞增多。而電刺激大鼠牙髓卻引起海馬CA1區(qū)c-fos的表達(dá)減少[9]。

膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛產(chǎn)生及維持中也發(fā)揮了重大作用。在病理性痛刺激作用下,激活的膠質(zhì)細(xì)胞可釋放多種神經(jīng)活性物質(zhì),如花生四烯酸、白細(xì)胞三烯、前列腺素、一氧化氮、興奮性氨基酸、神經(jīng)生長因子等[10]，這些活性物質(zhì)直接調(diào)控著神經(jīng)元的活動，它們作用于痛覺傳遞神經(jīng)元使其處于敏化狀態(tài)，而活化的膠質(zhì)細(xì)胞可以進(jìn)一步加強(qiáng)初級傳入纖維終末釋放SP、EAA和增加產(chǎn)生疼痛物質(zhì)神經(jīng)元的興奮性來調(diào)節(jié)疼痛[11]，同時(shí)通過調(diào)控神經(jīng)活性物質(zhì)的攝取間接影響神經(jīng)元的生物活性[12]。本課題組以往的研究顯示咬合創(chuàng)傷引起了三叉神經(jīng)脊束核初級感覺中樞內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞因子的RNA表達(dá)變化[5]，咬合創(chuàng)傷后三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核內(nèi)GFAP、IL-1、TNFαmRNA表達(dá)上調(diào)，且三者呈現(xiàn)一致性相關(guān)變化規(guī)律，但對于神經(jīng)系統(tǒng)的高級核團(tuán)海馬是否參與了咬合創(chuàng)傷的口頜面痛反應(yīng)卻未見報(bào)道。星形膠質(zhì)細(xì)胞中的膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acid protein,GFAP)，是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，可利用GFAP的特異性抗體檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)通過對海馬區(qū) GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫染色發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷后7d，海馬內(nèi)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)開始增加，2w組GFAP陽性細(xì)胞數(shù)繼續(xù)上升，4w時(shí)達(dá)到高峰。主要分布在CA1區(qū)及CA3區(qū)，但以CA3區(qū)為主，5w時(shí)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)開始下降。但仍保持較高水平。通過實(shí)驗(yàn)我們觀察到，咬合創(chuàng)傷的刺激引起了海馬CA1、CA3區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量增加，提示海馬結(jié)構(gòu)參與了咬合創(chuàng)傷反應(yīng)，推測海馬的CA1、CA3區(qū)與咬合創(chuàng)傷所致口頜面痛及痛情緒調(diào)控關(guān)系密切，尤其CA3區(qū)，是口面部傷害性刺激的主要投射區(qū)。

[1]Aggleton JP,Vann SD,Oswald CJ,et al.Identifing cortical inputs to the rat hippocampus that subserve allocentric spatial processes：a simple problem with a complex answer[J].Hippocampus,2000,10(4)：466

[2]海 德.海馬與近期記憶有關(guān)[J].國外醫(yī)學(xué)情報(bào),2001,22(1)：25

[3]朱美玲,劉洪臣,郝作琦,等.咬合創(chuàng)傷大鼠 Vc內(nèi)SP和NMDAR1的表達(dá)[J].口腔頜面修復(fù)學(xué)雜志,2002,3：215-217

[4]董 研，劉洪臣，武勝昔,等.TrkA及PPTAmRNA在咬合創(chuàng)傷犬三叉神經(jīng)節(jié)的表達(dá)變化[J].口腔頜面修復(fù)學(xué)雜志,2003,4(1)：4-7

[5]賈 靜，劉洪臣，章捍東,等.咬合創(chuàng)傷下大鼠三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)及其與細(xì)胞因子的關(guān)系[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志,2005,3(3)：132-134

[6]Wu Xuan,Li Hai-Di.Effects of intra-hippocampal injection of interleukin-2 on pain threshold and for maldehyde-induced substance P-like immunoreactivity in periaqueductal gray and spinal cord[J].Acta Pharmacol Sin,1999,20：839-843

[7]Khanna S.Dorsal hippocampus field CA1 Pyra midal cell responses to a persistent versus an acute nociceptive stimulus andtheir septalmodulation[J].Neuroscience,1997,77：713-721

[8]Khanna S,Sinclair J.G.Responses in the CA1 region of the rat hippocampus to a noxious stimulus[J].Exp Neurol,1992,117：28-35

[9]Rygh LJ,Sevendsen F,Hole K et al.Noxious tooth pulp stimulation suppresses c-Fos expression in the rat hippocampus formation[J].Brain Res,1999,827：215-220

[10]Kreutzberg GW.Microglia：a sensor for pathological events in the CNS[J].Trends Neurosci,1996,19：312-318

[11]Watkins LR,Milligan ED,Maiser SF.Glial proinflammatory cytokines mediate exaggerated pain states：implications for clinical pain.In：Machelska H,Stein C,editor.Immune mechanisms of pain&analgesia[J].Austin TX：Landes Biosciences,2001：199-213

[12]Inoue A,Ikoma K,Morioka N,et al.Interleukin-1 beta induces substance P release from primary afferent neurons through the cyclo oxygenase-2 system[J].J Neurochem,1999,73：2206-2213