王 凡，朱玲玲，陳曉萍，劉國(guó)樹，范 明△

(1.解放軍總醫(yī)院南樓心血管二科，北京 100853;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850)

骨骼肌成肌細(xì)胞(skeletal myoblasts，SkMs)具有自我更新和分化形成肌纖維的能力[1]。既往誘導(dǎo)SkMs體外增殖的研究多集中在細(xì)胞因子領(lǐng)域，如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子等。自2001年Csete等報(bào)道了6%O2可以促進(jìn)SkMs體外增殖[2]，物理因素對(duì)SkMs體外增殖的影響逐漸受到人們的關(guān)注。低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducing factor-1α，HIF-1α)是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，活化的HIF-1α與其靶基因上的低氧反應(yīng)元件結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄，這些靶基因編碼的蛋白質(zhì)參與了細(xì)胞的代謝、增殖、凋亡等諸多功能。本工作觀察了低氧(3、10%O2)對(duì)小鼠SkMs增殖的影響并探討了HIF-1α在低氧促SkMs增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

胎牛血清(FBS):德國(guó)Biochem AG公司;Desmin抗體 、鼠抗HIF-1α抗體:美國(guó) Chemicon 公司;羊抗 βactin內(nèi)參抗體:美國(guó)SantnCruze公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗、ECL顯色試劑盒:美國(guó)Vector公司;Trizol試劑盒、焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)原液:美國(guó)Gibico公司;氯仿、異丙醇、乙醇為北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司;MgCl2、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒:美國(guó) Life Technologies公司;Taq聚合酶、RNasin、PCR Master:美國(guó) Promega公司;DL-2000DNA Ladder:大連寶生物公司。瓊脂糖凝膠:上海YITO公司;核胞漿蛋白提取試劑盒:普利萊基因技術(shù)有限公司;蛋白定量試劑盒:美國(guó)Sigma公司。

低氧溫箱:美國(guó)Forma Scientific公司;流式細(xì)胞儀:FACSCalibur型，美國(guó)Becton Dickinson公司;PE-480PCR擴(kuò)GC710圖象分析儀增儀、凝膠電泳系統(tǒng)、電泳槽Mini-ProteanII、電泳轉(zhuǎn)移儀Power-Pac 200:美國(guó)Bio-RAD公司;臺(tái)式冷凍離心機(jī):德國(guó)Hettich公司。

1.2 SkMs分離、培養(yǎng)與鑒定

取4～5周齡Wistar雄性大鼠麻醉，無菌切取后腿肌群，用D-Hank's液反復(fù)沖洗并充分剪碎后，用連續(xù)差速貼壁法分離培養(yǎng)SkMs[3]。將分離純化的SkMs接種在培養(yǎng)皿中，用 SkMs特異性標(biāo)記物-Desmin免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定并在顯微鏡下觀察、拍照。

1.3 低氧對(duì)SkMs增殖的影響

將分離純化的SkMs按一定密度接種在培養(yǎng)皿中，分別在常氧、3%O2和10%O2的環(huán)境培養(yǎng)3 d后，用Desmin免疫細(xì)胞化學(xué)染色，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.4 低氧對(duì)SkMs細(xì)胞周期的影響

將分離純化的SkMs按一定密度接種在培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞隨機(jī)分為兩組:常氧組(20%O2)和低氧組(10%O2)，培養(yǎng) 12 h、24h、36 h 時(shí) ，將兩組細(xì)胞分別消化分散離心，用70%冰乙醇-20℃固定24h，洗滌溫育后加入5 mg/100ml溴化乙錠染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析結(jié)果。

1.5 RT-PCR方法檢測(cè) SkMs HIF-1α mRNA表達(dá)

將分離純化的SkMs按一定密度接種在培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞隨機(jī)分為兩組:常氧組(20%O2)和低氧組(10%O2)，培養(yǎng) 2 h 、4h 、8 h 、12 h 、16h 、24h 、36 h 、48 h、72 h時(shí)用Trizol試劑盒抽提低氧組和常氧對(duì)照組細(xì)胞總RNA;用反轉(zhuǎn)錄體系反轉(zhuǎn)錄為cDNA;在一定反應(yīng)條件下用HIF-1α引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。HIF-1αcDNA引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。HIF-1α引物序列為:5-ATC AGC CAG CAA GTC CTT CT-3 ，5-TGC CTT AGC AGT GGT CGT T-3，擴(kuò)增長(zhǎng)度518 bp。以18s cDNA引物序列作為內(nèi)參照，其序列為:5-TTA TGG TTC CTT TGG TCG CT-3;5-ATG TGG TAG CCG TTT CTC AG-3;擴(kuò)增長(zhǎng)度為355 bp。引物擴(kuò)增條件為:94℃5 min，94℃45 s，61℃45 s，72℃45 s，25個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，用UVP凝膠圖像成像系統(tǒng)掃描定性并攝像電泳條帶的灰度，以確定擴(kuò)增物的相對(duì)量。

1.6 Western blot方法檢測(cè)SkMs HIF-1α總蛋白水平

將分離純化的SkMs按一定密度接種在培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞隨機(jī)分為兩組:常氧組(20%O2)和低氧組(10%O2)，培養(yǎng)2 h、4h、8 h 、12 h 、24h 、48 h 時(shí)用細(xì)胞刮刀收集低氧組和常氧組細(xì)胞，按核胞漿蛋白提取試劑盒提出細(xì)胞總蛋白，用Western-blot方法檢測(cè)蛋白，特異性的反應(yīng)條帶通過ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯色，X光膠片曝光、洗片、拍照。

1.7 Western blot方法檢測(cè)SkMs胞漿和胞核HIF-1α蛋白水平

將分離純化的SkMs按一定密度接種在培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞隨機(jī)分為兩組:常氧組(20%O2)和低氧組(10%O2)，培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞，按核胞漿蛋白提取試劑盒方法分別提取SkMs胞漿和胞核蛋白，蛋白濃度測(cè)量和檢測(cè)操作步驟同1.6。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。兩樣本均數(shù)比較采用 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 低氧促大鼠SkMs體外增殖

在常氧(20%O2)和低氧(3%，10%O2)環(huán)境中培養(yǎng)3 d后，Desmin陽(yáng)性的平均細(xì)胞數(shù)分別為416±10，633±32和 1043±67，經(jīng)過 3%和 10%低氧處理，SkMs的數(shù)目分別是常氧組的1.5和2.5倍，該結(jié)果表明:低氧能夠明顯促進(jìn)SkMs增殖(圖1，P＜0.05)，10%的低氧環(huán)境更有利于SkMs的增殖。

Fig.1 Effect of hypoxia on the proliferation of skeletal myoblasts(SkMs)

2.2 低氧對(duì)大鼠SkMs周期的影響

為了明確低氧促進(jìn)SkMs數(shù)量增加主要來源于細(xì)胞增殖，而不是凋亡細(xì)胞數(shù)目增加，我們用流式細(xì)胞儀測(cè)定了SkMs的周期分布，發(fā)現(xiàn)在12 h時(shí)低氧(10%O2)組細(xì)胞59.96%處于S期，而常氧(20%O2)組細(xì)胞有39.56%處于S期，其余處于G0/G1期，用增殖指數(shù)(proliferative index，PI)公式PI(%)=(S%+G2/M%)/(G0/G1%+S%+G2/M%)×100%計(jì)算出各組的增殖指數(shù)，結(jié)果表明12 h時(shí)低氧組細(xì)胞增殖指數(shù)高于常氧組(P＜0.05)，24h后兩組細(xì)胞增殖指數(shù)無明顯差異(表1)。流式結(jié)果還顯示各組均沒有明顯細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期分析結(jié)果見表1。

Tab.1 Effect of hypoxia on cell cycle(，n=4)

Tab.1 Effect of hypoxia on cell cycle(，n=4)

Con 20%:Normoxia group(20%O2);Hy 10%:Hypoxia group(10%O2);PI:Proliferation index.PI of SkMs in hypoxia is higher than that in normoxia at 12 h*P＜0.05 vs normoxia group

Group 12 h G2-M S PI 24h G2-M S PI 36 h G2-M S PI Con20% 0 39.56±0.3139.56±0.31 5.26±0.2143.71±0.3349.01±0.35 9.29±0.1529.2±0.8838.57±0.46 Hy10% 0 59.96±0.97 59.9±0.97* 7.08±0.5834.58±0.4743.67±0.22 6.89±0.3426.47±0.3633.39±0.25

2.3 低氧對(duì)大鼠SkMs HIF-1α mRNA表達(dá)的影響

不同時(shí)間點(diǎn)收集常氧組和低氧組細(xì)胞用RTPCR的方法檢測(cè)HIF-1α mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明，常氧條件下C2C12細(xì)胞即有HIF-1αmRNA的持續(xù)表達(dá)，且常氧組和低氧組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)HIF-1α mRNA的表達(dá)無明顯差異(圖2)。

Fig.2 Effect of hypoxia on the expression of HIF-1αmRNA in SkMs

2.4 低氧對(duì)大鼠SkMs HIF-1α總蛋白水平的影響

研究表明大多數(shù)細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)主要受蛋白水平的調(diào)控，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:常氧條件下C2C12細(xì)胞即有HIF-1α蛋白的表達(dá)，且常氧組和低氧組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)HIF-1α蛋白的表達(dá)無明顯變化(圖3)。

Fig.3 Effect of hypoxia on the expression of HIF-1αproteinum in SkMs

2.5 低氧對(duì)大鼠SkMs胞漿和胞核HIF-1α蛋白水平的影響

我們分別檢測(cè)了常氧和低氧條件下C2C12細(xì)胞胞漿和核HIF-1α蛋白水平。在常氧和低氧(10%O2)條件下培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，按核胞漿蛋白提取試劑盒方法分別提取SkMs胞漿和胞核蛋白，結(jié)果表明:常氧條件下細(xì)胞胞漿HIF-1α蛋白水平高于核HIF-1α蛋白水平，而低氧條件下，結(jié)果恰好相反，核內(nèi)HIF-1α蛋白水平高于胞漿HIF-1α蛋白水平(圖4，左圖為Western blot結(jié)果，右圖數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析是來自3次試驗(yàn)的結(jié)果)。

Fig.4 Expression of HIF-1αproteinum in endochylema and intranucelus under normoxia or hypoxia

3 討論

早在1976年Kunze等人發(fā)現(xiàn)，安靜狀態(tài)下脛骨前肌肉的氧濃度為2.1%～5%，運(yùn)動(dòng)中氧濃度會(huì)更低。1997年Evers等人[4]用微電極測(cè)量方法得知，隨電極擺放位置不同，人體骨骼肌氧濃度在1.8%～10.5%之間，即肌肉組織中生理性氧濃度低于目前體外細(xì)胞培養(yǎng)的氧濃度(20%O2)。由此人們?cè)O(shè)想低氧環(huán)境可能更有利于SkMs的增殖與分化，這一點(diǎn)被后來的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)[5]。本研究進(jìn)一步比較了不同氧濃度對(duì)大鼠SkMs增殖的影響，并初步探討了HIF-1α在低氧促SkMs增殖中的作用。

從Desmin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)的結(jié)果我們可以得出，低氧(3%、10%O2)可以促進(jìn)大鼠SkMs體外增殖(P＜0.05)，不同氧濃度對(duì)SkMs增殖的效果不同，10%的低氧環(huán)境更有利于SkMs的增殖。從流式細(xì)胞儀的結(jié)果可知，低氧12～24h時(shí)低氧組細(xì)胞增殖指數(shù)明顯高于常氧組，且細(xì)胞大多處于DNA合成期(S期)，24h之后兩組細(xì)胞的增殖指數(shù)無明顯差異?？梢?，SkMs在低氧24h內(nèi)增殖速度最快，延長(zhǎng)低氧時(shí)間，細(xì)胞增殖減慢。通過本研究我們首次提出了10%O2可以促進(jìn)SkMs體外增殖，并證實(shí)輕度低氧較中度低氧對(duì)SkMs的促增殖作用更加明顯。

既往的研究表明，常氧下HIF-1α被脯氨酸羥化酶(PHD)羥化，進(jìn)而被蛋白酶體降解，因此常氧下檢測(cè)不到HIF-1α的表達(dá);但在低氧環(huán)境中脯氨酸羥化酶的羥化作用被抑制，HIF-1α不能被降解而導(dǎo)致其在胞漿中聚集，從而進(jìn)入核內(nèi)，促進(jìn)了下游靶基因的表達(dá)[6]。因此，HIF-1α在胞漿內(nèi)的量的增多是調(diào)節(jié)下游靶基因的關(guān)鍵[7]。

然而本研究的結(jié)果顯示，SkMs在常氧下即有HIF-1α mRNA和蛋白水平的表達(dá)，且與低氧下HIF-1α mRNA和蛋白水平無顯著差異。這與我們研究過的神經(jīng)干細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞十分不同，這些細(xì)胞常氧條件下均檢測(cè)不到HIF-1α蛋白的表達(dá)。Stroka等人[8]曾經(jīng)報(bào)道，HIF-1α蛋白在心、腦、腎、肝、肌肉等組織的表達(dá)不同，肌肉組織在常氧下即有HIF-1α蛋白的表達(dá)，其他組織在中重度低氧(≤6%O2)時(shí)才表達(dá)。由此，HIF-1α在肌肉組織或SkMs中表達(dá)的特殊性，提示著肌肉組織或SkMs中的HIF-1α受低氧調(diào)控的方式可能與其他組織和細(xì)胞不同。

我們進(jìn)一步用Weston blot方法分別檢測(cè)了常氧和低氧條件下SkMs胞漿和胞核中HIF-1α蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，常氧條件下胞漿HIF-1α蛋白水平高于核HIF-1α蛋白水平，而低氧狀態(tài)下，胞核中HIF-1α蛋白水平高于胞漿HIF-1α蛋白水平。由結(jié)果我們推測(cè)，SkMs中的HIF-1α受低氧調(diào)節(jié)的方式可能與眾不同，HIF-1α的活化更可能是通過氧濃度特異性調(diào)節(jié)HIF-1α蛋白核轉(zhuǎn)位增加，HIF-1α核轉(zhuǎn)位的發(fā)生與胞漿中HIF-1α蛋白量的多少?zèng)]有關(guān)系，只受到氧濃度的特異性調(diào)節(jié)。低氧條件下，SkMs胞漿中的HIF-1α進(jìn)入細(xì)胞核中，在核中高度聚集，與 HIF-1β亞基結(jié)合活化啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)下游與SkMs增殖相關(guān)的靶基因，促進(jìn)SkMs增殖。本工作發(fā)現(xiàn)與Kubis等人[9]的報(bào)道一致，他們用免疫熒光的方法發(fā)現(xiàn)，常氧條件下HIF-1α分布在SkMs胞漿而低氧條件下HIF-1α聚集在SkMs核內(nèi)。由此，低氧對(duì)SkMs增殖的調(diào)控或許并不是通過調(diào)節(jié)HIF-1α蛋白表達(dá)量的多少來實(shí)現(xiàn)，更有可能是通過調(diào)節(jié)HIF-1α核轉(zhuǎn)位的過程。

綜上所述，輕中度低氧促進(jìn)了大鼠成肌細(xì)胞的增殖，為體外擴(kuò)增成肌細(xì)胞提供了新的思路;HIF-1α可能是通過氧濃度調(diào)控的核轉(zhuǎn)位的方式參與了低氧促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖，確切的機(jī)制需要進(jìn)一步的深入研究。

[1]Buckingham M，Montarras D.Skeletal muscle stem cells[J].Curr Opin Genet Dev，2008，18(4):330-336.

[2]Csete M，Walikonis J，Slawny N，et al.Oxygen-mediated regulation of skeletal muscle satellite cell proliferation and adipogenesis in culture[J].J Cell Physiol，2001，189(2):189-196.

[3]陳曉萍，劉 紅，吳 燕，等.成人成肌細(xì)胞快速高效分離方法的建立[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2003，2(6):404-406.

[4]Evers B，Odemis V，Gerngross H，et al.Intramuscular oxygen partial pressure in patients with chronic exertional compartment syndrome[J].Adv Exp Med Biol，1997，428(4):311-316.

[5]Kook S H，Son Y O，Lee K Y，et al.Hypoxia affects positively the proliferation of bovine satellite cells and their myogenic differentiation through up-regulationofMyoD[J].Cell Biol Int，2008，32(8):871-878.

[6]Jaakkola P，Mole D R，TianY M ，et al.Targeting of HIF-a to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation[J].Sci，2001，292(5516):468-472.

[7]Hieber S，Huhn R，Hollmann M W，et al.Hypoxia-inducible factor 1 and related gene products in anaesthetic-induced preconditioning[J].Eur J Anaesthesiol，2009，26(3):201-206.

[8]Stroka D M，Burkhardt T，Desbaillets I，et al.HIF-1 is expressed in normoxic tissue and displays an organic-specific regulation under systemic hypoxia[J].FASEB J，2001，15(13):2445-2453.

[9]Kubis HP，Hanke N，Scheibe R J，et al.Accumulation and nuclear import of HIF1 alpha during high and low oxygen concentration in skeletalmuscle cells in primary culture[J].Biochim BiophysActa，2005，1745(2):187-195.