葉挺梅，錢令波，崔 潔，王會平，葉治國，夏 強△

(1.麗水學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)院生物系，浙江 麗水 323000;2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，杭州 310058)

心肌梗死是當(dāng)今人類的主要致死原因之一，血栓阻塞冠狀動脈導(dǎo)致不可逆的心肌細(xì)胞損傷，時間依賴性的由心內(nèi)膜擴(kuò)展到外膜，必須進(jìn)行急性心梗的再灌注治療。最有效的治療心肌梗死的方法是盡快疏通閉塞的血管，恢復(fù)血供，從而阻止細(xì)胞壞死的擴(kuò)展。早期再灌注是缺血心肌存活的必要前提。然而，再灌注本身可引起細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重，即再灌注損傷，再灌注損傷的臨床表征包括心肌壞死、心律失常、心肌頓抑、內(nèi)皮和微血管功能失調(diào)甚至無復(fù)流現(xiàn)象[1]。盡管已有大量的動物實驗報道藥物預(yù)處理、后處理，缺血預(yù)處理、后處理，遠(yuǎn)距預(yù)處理等均能減少心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷[2，3]，但是因為心肌I/R損傷的病理機制極其復(fù)雜，主要涉及再灌注早期的氧自由基爆發(fā)、中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎性損傷、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載等[3]。迄今為止，尚沒有有效的措施來減少臨床上心肌I/R損傷。黑木耳(auricularia auricula)是我國珍貴的藥用和食用膠質(zhì)真菌。黑木耳多糖(auricularia auricular polysaccharides，AAP)為其重要活性成分，具有降血糖、抗脂質(zhì)過氧化及清除氧自由基等多種生物活性，已在多種動物模型上得到證實[4，5]。但是有關(guān)黑木耳多糖的心血管作用卻罕見報道。因此，本實驗應(yīng)用Langendorff灌流模型研究AAP對離體大鼠心臟I/R時心功能指標(biāo)、脂質(zhì)過氧化程度及自由基清除能力的影響，為黑木耳的保健和治療I/R損傷等疾病提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

Tris-HCl，EDTA-2Na，氯化三苯四氮唑(2，3，5-triphenyl-tetrazolium chloride，TTC)購自 Sigma公司。LDH、MDA和SOD檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。復(fù)方丹參液，江蘇省東臺市制藥廠生產(chǎn)，每毫升相當(dāng)于1.5 g生藥，批號20070830。AAP:黑木耳干粉按1∶90(w/v)加水浸泡30min，加入纖維素酶和果膠酶酶解，加熱至90℃使酶滅活，熱水浸提、離心、減壓濃縮后，用 95%乙醇沉淀多糖，靜置過夜、洗滌，將多糖沉淀復(fù)溶，加入氯仿與正丁醇、Sevage試劑反復(fù)脫蛋白、離心，減壓濃縮、真空冷凍干燥后得到黑木耳多糖粉末。其余試劑為市售分析純。改良Krebs-Henseleit(K-H)液(mmol/L):NaCl 118 ，KCl 4.7 ，KH2PO41.2 ，MgSO41.2 ，NaHCO325 ，glucose 10，CaCl22.5。

1.2 離體心臟Langendorff灌流和左室功能評價

雄性SD大鼠(體重230～260g，由浙江大學(xué)實驗動物中心供應(yīng))，4%水合氯醛10ml/kg體重進(jìn)行麻醉，斷頭后開胸迅速取出心臟，置于4℃改良K-H液中洗凈血液，迅速轉(zhuǎn)移、固定于Langendorff灌流裝置，以改良K-H液行常規(guī)恒壓(10.1 kPa)灌流，維持灌流液溫度35℃。切開左心耳，將充水乳膠囊由此插入至左心室，囊內(nèi)壓力經(jīng)特氟綸管傳遞至壓力傳感器，由PowLab生物信號采集處理系統(tǒng)記錄和分析。向插入左心室內(nèi)的乳膠囊注水使左心室舒張末壓(1eft ventricular end diastolic pressure，LVEDP)維持于0.53～1.07 kPa，連續(xù)記錄實驗過程中左心室發(fā)展壓(1eft ventricular developed pressure，LVDP)、心率(heart rate，HR)、心率與發(fā)展壓的乘積(rate pressure product，RPP)、左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(maximal rise/fall rate of left ventricular pressure，±dP/dtmax)等各項指標(biāo)。

1.3 I/R處理方法

采用全心停灌的處理方法，平衡20min后，以停止灌流30min，復(fù)灌120min作為I/R過程。

1.4 冠脈流量的測定

在平衡末1 min及復(fù)灌30，60，90，120min的最末1 min收集冠脈流出液，測量其體積作為相應(yīng)時間點的冠脈流量(coronary flow，CF)。

1.5 冠脈流出液乳酸脫氫酶活性的測定

在復(fù)灌各時間點收集冠脈流出液，按照試劑盒要求，用分光光度法測定乳酸脫氫酶(1actate dehydrogenase，LDH)的含量。原理為LDH催化丙酮酸鹽還原生成乳酸，同時NADH被氧化成NAD+，引起340nm吸光度的下降，其下降速率與樣本中LDH活力成正比，通過吸光度變化率計算LDH活性。

1.6 心肌細(xì)胞活性的測定

TTC與活細(xì)胞反應(yīng)生產(chǎn)甲月贊(formazan)，該物質(zhì)是反映心肌活性的指標(biāo)之一。心臟從灌流裝置上取下后切成薄片(1～2 mm)，在37℃水浴中用1%TTC孵育30min。取出心肌片吸干表面的水分并稱其濕重，按20ml/g的量加入二甲基亞砜后勻漿，勻漿液離心(2623 r/min，10min)，取上清液1 ml在 490nm處測量其吸光度以反映心肌formazan水平。

1.7 心肌組織MDA和SOD水平測定

實驗結(jié)束時取下心臟，迅速減去左右心房及房室隔，稱重，再迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的勻漿液中(10mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA-2Na，10mmol/L sucrose ，0.8%NaCl，pH 7.4)剪碎 ，用內(nèi)切式組織勻漿器制成10%的組織勻漿(勻漿時間每次10s，間歇30s連續(xù)3次，在冰水中進(jìn)行)。取10%的組織勻漿5～ 10ml，以 3000r/min，4℃離心 10min，取上清液用以測定酶活力。以硫代巴比妥酸法測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)，以黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)法定量。

1.8 實驗分組

大鼠隨機分為6組(n=10):(1)AAP高劑量組(HAAP):正常大鼠灌胃 AAP(200mg/(kg?d))共 4周，再行離體心臟全心 I/R;(2)AAP中劑量組(MAAP):正常大鼠灌胃AAP(100mg/(kg?d))共 4周，再行離體心臟全心I/R;(3)AAP低劑量組(LAAP):正常大鼠灌胃AAP(50mg/(kg?d))共4周，再行離體心臟全心I/R;(4)正常對照組(Con):正常大鼠灌胃同等體積的生理鹽水共4周，再行離體心臟Langendorff灌流170min;(5)模型對照組(I/R):正常大鼠灌胃同等體積的生理鹽水共4周，再行離體心臟全心I/R;(6)復(fù)方丹參陽性對照組(Compound Radix Salviae Miltiorrhizae，CRSM):正常大鼠灌胃丹參(4 ml/(kg?d))共4周，再行離體心臟全心I/R。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 AAP預(yù)處理對I/R心臟左心室收縮功能及冠脈流量的影響

與模型對照組(I/R)相比，低、高劑量AAP(50，200mg/(kg?d))預(yù)處理4周后均明顯減弱I/R對LVDP、+dP/dtmax、RPP的抑制作用，AAP改善心功能的作用要強于CRSM(表1，表2)。與I/R組相比，HAAP組顯著抑制了I/R導(dǎo)致的CF減少，LAAP組與CRSM組對CF作用不明顯(表3)。

Tab.1 Effect of 4 week treatmentwith auricularia auricular polysaccharides(AAP)on RPP and LVDP in the isolated rat heart subjected to ischemia/reperfusion(，n=10)

Tab.1 Effect of 4 week treatmentwith auricularia auricular polysaccharides(AAP)on RPP and LVDP in the isolated rat heart subjected to ischemia/reperfusion(，n=10)

RPP:LVDP×HR;LVDP:Left ventricular development pressureI/R:Ischemia/reperfusion group;LAAP:Low dose of AAP(50mg/(kg?d))+ischemia/reperfusion group;HAAP:High dose of AAP(200mg/(kg?d))+ischemia/reperfusion group;CRSM:Compound radix salviae miltiorrhizae(4 ml/(kg?d))+ischemia/reperfusion group*P＜0.05，**P＜0.01 vs I/R group

Variable Baseline Reperfusion(min)30 60 90 120RPP(%of baseline(kPa×b/min))I/R 100(3661.24±562.28) 63.60±9.30 51.51±8.80 43.43±8.72 40.08±6.35 LAAP 100(3418.97±550.08) 72.44±14.04 65.52±11.81** 58.21±9.23** 53.21±9.07**HAAP 100(3910.12±643.75) 82.31±6.13** 72.70±7.63** 69.39±5.60** 68.24±4.48**CRSM 100(3426.16±436.21) 74.22±7.29 68.73±7.04** 58.94±9.45** 48.68±6.88*LVDP(%of baseline(kPa))I/R 100(12.72±1.09) 78.31±11.17 64.51±9.31 56.65±9.42 51.22±8.88 LAAP 100(12.15±1.56) 87.83±12.25 78.98±10.11** 69.61±10.58* 62.47±9.21*HAAP 100(12.15±0.83) 92.28±9.59* 85.92±9.05** 80.33±9.22** 75.65±8.77**CRSM 100(11.90±1.35) 89.10±10.90 77.89±10.90** 68.18±9.59* 59.53±10.30

Tab.2 Effect of 4 week treatmentwith auricularia auricular polysaccharides(AAP)on±dP/dtmax in the isolated rat heart subjected to ischemia/reperfusion(，n=10)

Tab.2 Effect of 4 week treatmentwith auricularia auricular polysaccharides(AAP)on±dP/dtmax in the isolated rat heart subjected to ischemia/reperfusion(，n=10)

±dP/dtmax:Maximal rise/fall rate of left ventricular pressureI/R:Ischemia/reperfusion group;LAAP:Low dose of AAP(50mg/(kg?d))+ischemia/reperfusion group;HAAP:High dose of AAP(200mg/(kg?d))+ischemia/reperfusion group;CRSM:Compound radix salviae miltiorrhizae(4 ml/(kg?d))+ischemia/reperfusion group*P＜0.05，**P＜0.01 vs I/R group

Variable Baseline Reperfusion(min)30 60 90 120+dP/dtmax(%of baseline(kPa/s))I/R 100(561.75±94.99) 80.20±10.38 78.98±12.51 69.51±11.11 71.11±11.81 LAAP 100(548.30±86.44) 89.23±11.56 82.52±11.12 76.36±10.25 70.12±9.49 HAAP 100(656.42±82.55) 103.61±10.92** 99.22±9.77** 91.88±9.14** 94.36±10.81**CRSM 100(649.48±55.96) 90.51±10.13 83.91±11.17 76.86±10.41 72.12±11.21-dP/dtmax(%of baseline(kPa/s))I/R 100(-405.1±41.8) 76.53±9.98 73.66±10.99 63.86±11.11 57.38±11.18 LAAP 100(-550.1±56.4) 77.58±9.53 75.37±10.17 68.21±9.02 60.41±9.12 HAAP 100(-628.2±70.5) 89.89±10.71* 79.82±9.89 69.91±9.79 60.21±10.49 CRSM 100(-439.5±56.9) 70.86±10.61 62.49±9.91 58.29±8.91 55.74±7.83

Tab.3 Effect of 4 week treatmentwith auricularia auricular polysaccharides(AAP)on coronary flow in the isolated rat heart subjected to ischemia/reperfusion(，n=10)

Tab.3 Effect of 4 week treatmentwith auricularia auricular polysaccharides(AAP)on coronary flow in the isolated rat heart subjected to ischemia/reperfusion(，n=10)

I/R:Ischemia/reperfusion group;LAAP:Low dose of AAP(50mg/(kg?d))+ischemia/reperfusion group;HAAP:High dose of AAP(200mg/(kg?d))+ischemia/reperfusion group;CRSM:Compound radix salviae miltiorrhizae(4 ml/(kg?d))+ischemia/reperfusion group*P＜0.05，**P＜0.01 vs I/R group

Variable Baseline Reperfusion(min)30 60 90 120I/R 100(7.8±0.4) 65.23±8.20 58.21±6.44 48.61±6.71 41.12±8.35 LAAP 100(7.25±0.78) 69.97±9.39 64.29±9.03 55.61±8.16 45.99±7.47 HAAP 100(8.03±0.48) 87.41±9.38** 80.91±9.65** 75.23±8.41** 68.98±8.88**CRSM 100(8.46±0.66) 73.18±9.75 68.66±9.57* 58.54±8.83* 53.23±7.70**

2.2 AAP預(yù)處理對I/R心肌梗死狀況及其LDH含量的影響

與模型對照組(I/R)相比，低、中、高劑量AAP(50，100，200mg/(kg?d))預(yù)處理4周后，心肌細(xì)胞活性明顯改善，表現(xiàn)為formazan含量明顯升高(P＜0.01)，呈劑量依賴性;高劑量AAP升高formazan含量的作用要強于CRSM，與空白對照組相比無顯著性差異(圖 1)。與 I/R組比較，低、中、高劑量AAP處理組復(fù)灌5 min、10min冠脈流出液中LDH含量顯著下降(P＜0.01)，且具有劑量依賴性;高劑量AAP抑制 I/R心肌LDH釋放的作用要強于CRSM(圖2)。

Fig.1 Effect of 4 week treatment with auricularia auricular polysaccharides(AAP)onformazan content in the isolated rat heart subjected to ischemia/reperfusion(，n=10)Con:Blank control group;I/R:Ischemia/reperfusion group;LAAP:Low dose of AAP(50mg/(kg?d))+ischemia/reperfusion group;MAAP:Middle dose of AAP(100mg/(kg?d))+ischemia/reperfusion group;HAAP:High dose of AAP(200mg/(kg?d))+ischemia/reperfusion group;CRSM:Compound radix salviae miltiorrhizae(4 ml/(kg?d))+ischemia/reperfusion group

2.3 AAP預(yù)處理對I/R心肌組織MDA和SOD水平的影響

與模型對照組(I/R)相比，AAP(100mg/(kg?d))預(yù)處理4周后明顯抑制I/R心肌MDA水平增加及SOD活性下降(P＜0.01)，AAP組MDA與SOD與空白對照(Con)相比無顯著性差異;AAP抑制I/R心肌MDA增加及SOD下降的作用要強于CRSM(圖3見下頁)。

Fig.2 Effect of 4 week treatment with auricularia auricular polysaccharides(AAP)on lactate dehydrogenase(LDH)in the coronary effluent of the isolated rat heart subjected to ischemia/reperfusion(，n=10)

3 討論

本實驗首次在離體灌流的大鼠心臟I/R模型上發(fā)現(xiàn)AAP預(yù)處理4周可減少I/R后心肌細(xì)胞死亡，增加冠脈流量，減少心肌標(biāo)志酶LDH的漏出，改善灌注后左心室收縮功能，并且呈劑量依賴性，這些作用可能與其增加SOD活性，減輕I/R脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

Fig.3 Effect of 4 week treatment with auricularia auricular polysaccharides(AAP)on malondialdehyde(MDA)level(A)and superoxide dismutase(SOD)activity in the isolated rat heart subjected to ischemia/reperfusion(，n=10)

已證實，心肌I/R將引起心功能下降、心律失常、心肌酶漏出以及線粒體受損等，其機制可能主要涉及心肌I/R時產(chǎn)生的氧自由基損傷[1]。有研究表明，黑木耳多糖、木耳多糖可明顯抑制MDA生成及線粒體腫脹，并能明顯清除超氧陰離子，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系[6]。黑木耳所含的多糖類物質(zhì)是酸性異葡聚糖，主要成分為木糖、葡萄糖醛酸、甘露糖及少量的葡萄糖和巖藻糖，有一定的抗炎癥、抗氧化作用[7]。本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)黑木耳多糖預(yù)處理的I/R組心肌SOD水平明顯高于模型對照(I/R)組，MDA含量較I/R組有顯著的降低，表明黑木耳多糖能顯著增強心肌的抗氧化能力，增強心肌對I/R損傷的耐受程度。本實驗結(jié)果也表明黑木耳多糖發(fā)揮抗氧化作用的主要機制是抑制MDA的過量生成和促進(jìn)SOD的活性，這可能與其高含量的酸性異葡聚糖有關(guān)。本實驗還發(fā)現(xiàn)黑木耳多糖的抗心肌I/R損傷的作用要強于冠心病治療藥物丹參，這有可能與黑木耳多糖極強的抗氧化性能有關(guān)，也預(yù)示著黑木耳多糖極有可能發(fā)展成為一種更高效的抗心肌I/R損傷藥物。

國內(nèi)外關(guān)于黑木耳多糖對心血管的保護(hù)作用研究較少，本實驗也僅僅局限于黑木耳多糖對I/R心肌的抗氧化作用研究。由于心肌I/R損傷機制復(fù)雜，牽涉到細(xì)胞內(nèi)鈣超載，中性粒細(xì)胞炎性反應(yīng)，線粒體功能紊亂等一系列病理變化[3]，單從抗氧化角度是不足以有效防治心肌I/R損傷的。黑木耳多糖含有豐富的羥基基團(tuán)，而且不同化學(xué)結(jié)構(gòu)和不同構(gòu)象的黑木耳多糖組分表現(xiàn)出不同的生理活性，黑木耳多糖能否通過對抗自由基的作用，從而減輕I/R對心肌細(xì)胞內(nèi)鈣庫，以及線粒體功能的影響尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，黑木耳多糖具有抗心肌I/R損傷的保護(hù)作用，其機制可能與其增加心肌SOD活性，減少脂質(zhì)過氧化損傷有關(guān)。進(jìn)一步深入研究黑木耳多糖對抗心肌I/R損傷的靶點以及相關(guān)的信號通路將具有非常重要的臨床前意義。

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