李邦河， 李 博,2, 沈躍峰,2

(1.中國科學院 數(shù)學與系統(tǒng)科學研究院，北京 100190;2.中國科學院 研究生院，北京 100049)

生命系統(tǒng)中幾乎所有的化學反應都有酶這種生物催化劑的參與,對酶進行研究可以幫助人們更好地理解生命過程,現(xiàn)在已知的大部分酶都是蛋白質(zhì).與其他化學催化劑相似，酶是通過降低反應物和產(chǎn)物之間的自由能壁壘來提高化學反應速度的.但是，酶與一般化學催化劑又有著明顯的不同:它們擁有比一般無機化學反應高出好幾個數(shù)量級的催化能力；可以在更加溫和的環(huán)境下(如常溫、常壓和近乎中性的條件下)進行催化反應；具有更高的反應專一性，這點使得酶催化反應幾乎沒有副產(chǎn)物.此外，酶的催化能力可以受非底物物質(zhì)濃度的調(diào)節(jié)[1-2].

酶動力學是研究酶催化反應速率的學科,并通過對催化速率及其在不同條件下的變化規(guī)律的研究來推斷反應機制.這是一種最古老并且仍然被認為是最重要的推斷催化機制的方法.早在1892年，Brown研究了有酵母存在的蔗糖發(fā)酵過程,發(fā)現(xiàn)當蔗糖濃度高于酶濃度時，反應速率反倒與蔗糖濃度無關(guān)[3];1902年，他提出這一現(xiàn)象可以由反應過程中形成了酶與底物的符合物來解釋[4].在高底物濃度下，由于酶的供給相對較少，此時的酶都是以復合物的形式存在的.因此，進一步增加底物濃度并不能再增加復合物.而產(chǎn)物的生成速率與復合物的濃度有關(guān)，因而底物濃度的增加幾乎不會影響反應物的生成速率.這一推斷被認為是酶動力學的開端，即首次利用化學反應速率的性質(zhì)推導出反應機制.關(guān)于Brown提出的模型及其后來的發(fā)展，可參閱文獻[5].幾乎在同一時期，Henri提出了2個單底物S單產(chǎn)物P反應機制模型[6].在每個模型中，酶E與底物S都形成了復合物C.本文將著重介紹其中研究最廣泛的一個，即后來以Michaelis-Menten命名的模型.另一個模型的簡介可以參閱文獻[7].這些模型均以化學動力學中的質(zhì)量作用定律(Law of Mass Action)為基礎，因此先簡單介紹一下質(zhì)量作用定律.

1 質(zhì)量作用定律

一個化學反應過程可以通過一系列的基本反應(elementary reaction)而發(fā)生,而基本反應則是指只經(jīng)過1個暫態(tài)(transtion state)的反應.Guldberg和Wagge在前人的基礎上，于1864年提出了化學反應速率與反應物的有效質(zhì)量成正比[8],即質(zhì)量作用定律，其中有效質(zhì)量實際是指濃度.實際上，質(zhì)量作用定律只對基本反應成立.用現(xiàn)在通行的名詞來描述，該定律為：恒溫下，基本反應的速率同反應物濃度冪次的積成正比，冪次的大小等于該反應物在化學反應中參與一次碰撞的分子個數(shù).

2 酶作用的Michaelis-Menten模型

Michaelis-Menten模型描述的是一個單底物單產(chǎn)物的酶催化過程，即酶(E)催化底物(S)轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物(P)的過程.這一過程可以分解為2個基本反應，第1個簡單反應是可逆過程，第2個簡單反應是不可逆的.反應機制如下：

(1)

式(1)中:k1和k-1是形成復合物C的正向和逆向反應速率常數(shù);k2是復合物C分解成產(chǎn)物的速率常數(shù).該模型是酶動力學中最簡單的模型.對其進行深入研究，有助于理解酶的催化機制;同時給更復雜的模型研究提供一些思路.

根據(jù)質(zhì)量作用定律，各反應物濃度滿足以下微分方程[9]：

dS(t)/dt=-k1S(t)E(t)+k-1C(t);

(2)

dE(t)/dt=-k1S(t)E(t)+(k-1+k2)C(t);

(3)

dC(t)/dt=k1S(t)E(t)-(k-1+k2)C(t);

(4)

dP(t)/dt=k2C(t).

(5)

給定初始條件

(S(0),E(0),C(0),P(0))=(S0,E0,0,0).

(6)

式(2)～式(6)中,E(t)，S(t)，C(t)以及P(t)分別表示反應時刻t時的酶、底物、酶底物復合物以及產(chǎn)物的濃度.由物質(zhì)守恒定律得:

E(t)+C(t)=E0;

(7)

S(t)+C(t)+P(t)=S0.

(8)

方程(5)～方程(8)等價于以下2個方程：

dS(t)/dt=-k1S(t)E(t)+k-1(E0-E(t));

(9)

dE(t)/dt=-k1S(t)E(t)+(k-1+k2)(E0-E(t)).

(10)

給定初始條件(S(0),E(0))=(S0,E0).方程(9)和方程(10)不是顯式可解的，生物學家們?yōu)榱诉M一步的研究，作了一些假設來簡化問題.

1913年，德國生化學家Michaelis和他的加拿大助手Menten在Henri工作的基礎上，提出了平衡假設(assumption of equilibrium)[10].假設k-1?k2，第1步反應相對于第2步快速達到平衡.在平衡狀態(tài)時，

(11)

式(11)中,K為酶反應第1步的解離常數(shù).根據(jù)這一假設，產(chǎn)物的生成速率可以表示為

(12)

在此基礎上可以研究酶的動力學性質(zhì).

注意到，平衡假設只有當?shù)?步反應速度相對于第1步反應很慢(體現(xiàn)在k-1?k2)，而且第2步反應不會干擾到第1步反應時才成立.實際上，這些條件在通常生理條件下往往是不能達到的，因此這一假設有很大的局限性.

3 擬穩(wěn)態(tài)假設

1925年，Briggs和Haldane指出平衡假設中酶、底物和復合物之間的快速平衡不一定總存在，因此提出了一個更通用的假設，即穩(wěn)態(tài)假設[11].在此直接引用著名生物化學教科書中的描述[2]:

在通常生理條件下，當?shù)孜餄舛冗h超過酶濃度時(S0?E0)，除反應起始階段外，該階段一般在E和S混和的幾μs之內(nèi)，C(t)保持近似常數(shù)，直至底物幾乎耗盡.因而C合成的速率，在反應的大部分歷程中必定與其消耗的速率相等，亦即C保持穩(wěn)態(tài)，C(t)可以當作常數(shù)來處理

dC(t)/dt=0.

(13)

由于在反應中，復合物濃度C(t)保持近似常數(shù)，即

dC(t)/dt≈0,

(14)

所以后來常常稱這個假設為擬穩(wěn)態(tài)假設(quasi-steady state assumption)[12].

由該假設知，當方程(13)成立時，有

k1S(t)E(t)-(k-1+k2)C(t)=0.

(15)

將方程(15)代入方程(7)，整理可得

(16)

(17)

記反應進入穩(wěn)態(tài)時的產(chǎn)物生成速度為v0，而此時的S(t)幾乎等于S0,于是

(18)

式(18)中,Vmax=k2E0.在之前的文獻中稱Vmax為最大速度,這是因為

(19)

實際上這一速度是個上界，永遠也達不到.

由于方程(17)的形式與方程(12)相同，為了承認和紀念Michaelis和Menten的貢獻，方程(18)被稱為米氏(Michaelis-Menten)方程，這是酶動力學的基本方程.

繼Briggs和Haldane的工作后，擬穩(wěn)態(tài)假設便成了酶動力學中的基本假設.圍繞著這一假設及米氏方程，生化學家們做了大量卓有成效的工作.人們找到了微分方程(9)和(10)的一些近似解析解[13].Lineweaver和Burk發(fā)現(xiàn)米氏方程的倒數(shù)形式可以用來估計反應常數(shù)Vmax和KM[14].這樣,k2便可以由Vmax=k2E0求出來.事實上，該倒數(shù)形式給出了1/v0，1/S和1/Vmax的線性關(guān)系，所以只需要對數(shù)據(jù)進行簡單的線性回歸就可以估計Vmax和KM.當然這一方法有很大的局限性，它給出的估測值準確度并不高[15]，但因其使用簡單、較直觀，且由它給出的解在沒有計算機的時代已經(jīng)相當不錯了，因此很多教科書還是會花一定的篇幅去介紹它[1,16-17].除此方法外，一些更精確的基于擬穩(wěn)態(tài)假設米氏方程的方法也被提了出來[18-20].

擬穩(wěn)態(tài)假設不但可以應用在酶動力學中,還可以應用到任何有類似動力方程的生化過程中，用以簡化復雜的系統(tǒng).實際上，這一假設已被用于系統(tǒng)生物學中的代謝過程及基因調(diào)控過程[21].

研究酶動力學的所有實驗也都表明,在底物濃度遠遠大于酶濃度時，擬穩(wěn)態(tài)假設及米氏方程給出了酶催化反應一個高度近似的描述[22].在單分子層面上，單個酶分子與溶劑分子發(fā)生不間斷的碰撞，在溶液中隨機游動并與底物發(fā)生相互作用[23-24].對單分子酶催化的隨機行為進行的統(tǒng)計分析表明，米氏方程仍然成立[22,24-26],即擬穩(wěn)態(tài)假設不只在宏觀角度上成立，在微觀單分子層面上也是高度符合的.

4 擬穩(wěn)態(tài)假設的合理性研究

盡管很多生化學家都利用擬穩(wěn)態(tài)假設來減少復雜生化反應系統(tǒng)中的方程數(shù)量，但對擬穩(wěn)態(tài)假設的合理性和適用范圍的理論研究卻很少.事實上，擬穩(wěn)態(tài)假設存在著錯誤地亂用[27].

第1個討論擬穩(wěn)態(tài)假設的是Laidler[28]，他認為S0?E0是一個很關(guān)鍵的條件.1988年，Segel通過估計反應中相關(guān)的時間尺度，提出了確保穩(wěn)態(tài)假設合理的條件[29].他認為,擬穩(wěn)態(tài)假設成立須滿足以下條件：

1)經(jīng)過一個初始時間段tC(在這段時間內(nèi)幾乎全部酶與底物充分結(jié)合形成飽和態(tài)的酶-底物復合物)，復合物的濃度C(t)保持近似常數(shù).在初始時間段內(nèi)，底物濃度幾乎不變.

2)底物濃度顯著變化的時間段tS要遠遠大于tC.

根據(jù)Segel的第1個條件，當時間t

(20)

在初始值C(0)=0的解為

(21)

(22)

底物濃度顯著變化的時間段tS則可以由總的底物濃度除以底物濃度的最大變化速率得到，即

(23)

由于底物的消耗速度在時間t>tC時等于產(chǎn)物的生成速度，所以由方程(17)可得

(24)

于是

(25)

根據(jù)Segel的第2個條件tS?tC，可以得到

(26)

由方程(22)和方程(26)可知，條件

E0?KM+S0

(27)

可以保證擬穩(wěn)態(tài)假設近似描述單底物酶催化反應的動力學過程.

最近,Hanson等發(fā)現(xiàn)初始瞬間(t

5 反擬穩(wěn)態(tài)假設和總擬穩(wěn)態(tài)假設

生物有機體內(nèi)的擬穩(wěn)態(tài)假設條件在某些時候是不能成立的[31],這種情況下運用擬穩(wěn)態(tài)假設得到的結(jié)果準確度非常差[32-33],故一些新的假設被提了出來.E0?S0是一種極端情形，反向于擬穩(wěn)態(tài)假設條件，即高酶濃度的反應動力學.從生物直覺上考慮，所有底物分子會迅速與酶分子結(jié)合在一起，也即可以認為反應過程中沒有底物分子的存在.那么,可以認為除了反應起始階段外，直到反應結(jié)束，dS(t)/dt≈0[33].這一假設被稱為反擬穩(wěn)態(tài)假設(reverse quasi-steady-state assumption).Schnell和Maini研究了這一假設，認為要使此假設成立，應滿足k2?k1[E]0或者S0?[E]0.基于此，產(chǎn)物的生成速率可以表示為

(28)

注意到，這一結(jié)果竟然與平衡假設得到的結(jié)果相同[34],其中的深刻關(guān)系還值得進一步研究.

(29)

(30)

同樣，他們給出了總擬穩(wěn)態(tài)假設近似成立的條件為

E0+S0?k2/k1或者k-1?k2或者KM+S0?E0.

(31)

最近，Pedersen等將總擬穩(wěn)態(tài)假設應用到更復雜的系統(tǒng)中[36].

6 擬穩(wěn)態(tài)定律

筆者研究擬穩(wěn)態(tài)假設的合理性和擴展它的適用范圍都是基于穩(wěn)態(tài)假設，給出了假設成立的必要條件和反應在某些階段的近似解，但都沒有直接從擬穩(wěn)態(tài)假設的條件出發(fā)，嚴格地驗證假設的正確性.從數(shù)學的嚴格性來看，這些問題的處理都比較模糊.

基于上述考慮，把擬穩(wěn)態(tài)假設相應地用數(shù)學語言重新表述為如下2個版本：

擬穩(wěn)態(tài)定律1給定任意小的正數(shù)ε，存在一個正數(shù)U，使得當S0>U時，C(t)將在小于ε的時間內(nèi)，從0增加到E0-ε，然后C(t)一直保持在區(qū)間[E0-ε,E0]內(nèi)，直到S(t)/S0<ε.

文獻[37]證明了在S0>U時，擬穩(wěn)態(tài)定律1和擬穩(wěn)態(tài)定律2對于任意正的速率常數(shù)k1,k2和k-1都成立.這也就是稱其為定律的原因.當然，U的選擇與E0，ε和速率常數(shù)有關(guān).

擬穩(wěn)態(tài)定律1的證明是通過研究方程(9)和方程(10)確定的S-E相平面的動力學性質(zhì)得到的.平面S-E的第一象限可以被分成5個部分，其中感興趣的是:

實際上，L1和L2分別是雙曲線-k1S(t)E(t)+(k-1+k2)(E0-E(t))=0和-k1S(t)E(t)+k-1(E0-E(t))=0在S(t)≥0的部分，它們相交于點(0,E0).易知:

(32)

(33)

(34)

(35)

這樣可以很容易證明以下幾個引理，通過這些引理，擬穩(wěn)態(tài)定律1便可以得到證明.

引理1方程(9)和方程(10)滿足初始條件(S(0),E(0))=(S0,E0)的解(S(t),E(t))將在某個時刻T0>0到達曲線L1.

引理3酶濃度E(t)和底物濃度S(t)將下降，直到(S(t),E(t))到達曲線L1，然后它水平穿過L1，進入?yún)^(qū)域R2并永遠保持在該區(qū)域中.在R2中，S(t)將不斷下降，而E(t)不斷增加.最后，(S(t),E(t))將趨向于點(0,E0).

引理4給定酶的初始濃度E0和任意小的正數(shù)ε，總存在一個正數(shù)U0，如果初始底物濃度S0>U0，則E(t)將在時間ε內(nèi)下降到小于ε的水平.

擬穩(wěn)態(tài)定律2的證明則相對復雜許多，需要研究如下方程組的動力學性質(zhì):

(36)

初值條件為(C(0),V(0))=(0,k1S0E0).有興趣的讀者可參閱文獻[37].

7 研究方向探索

酶動力學是一個充滿活力的學科，有大量問題值得深入探討.這是生物學與數(shù)學的一個很好的接口.酶動力學中有很多方面需要數(shù)學，需要用數(shù)學的語言將一些模糊的地方精確化，基本的數(shù)學參考書是文獻[38-39].筆者在閱讀酶動力學方面的文獻時發(fā)現(xiàn)，該領域還有大量的東西需要嚴格表述，如反擬穩(wěn)態(tài)假設、總擬穩(wěn)態(tài)假設等等.生物學家們往往有很好的直覺，但他們給出的很多結(jié)論都是描述性的.同樣，在數(shù)學的推導過程中也可以啟發(fā)一些新的想法.例如，最近我們提出了一種新的方法用以測量Michaelis-Menten模型中所有的參數(shù)[40]，這便是一個很好的例子.再者，這些誘導出來的數(shù)學問題本身也有數(shù)學上的趣味，如最近Calder和Siegel的研究結(jié)果[41].我們注意到，方程(9)和方程(10)可以確定一個多項式組，那么一些相關(guān)的問題可以用代數(shù)幾何的方法來解決.事實上，本文的部分結(jié)果就是利用代數(shù)幾何的方法得到的，但是為了使文章易于理解，最后寫出來的方法都只用到了分析學的工具.2009年5月,來自里爾大學的Francois Boulier在數(shù)學機械化國際會議上(ICMM’09)作了題為《On Applications of differential elimination to modeling problems in Biology》的報告，他利用計算代數(shù)幾何中的微分消去法研究了擬穩(wěn)態(tài)假設相關(guān)問題.由此可見，這一領域可以用很多工具來研究.

本文只是簡單回顧了酶動力學中Michaelis-Menten模型的發(fā)展歷程，并介紹了我們在這一方向上的新成果，希望能以此激發(fā)數(shù)學工作者的研究興趣.

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