魏 明 盧永申 張俊峰 李盼盼

(鄭州大學第五附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450052)

分別采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試驗法對系膜細胞外基質(zhì)Ⅳ型膠原(ColⅣ)、纖維連接蛋白(FN)、轉(zhuǎn)化生長因子 β1(TGF-β1)mRNA表達和體外培養(yǎng)合成分泌水平進行檢測,旨在探討不同濃度游離脂肪酸(FFAs)對系膜細胞外基質(zhì) ColⅣ、FN、TGF-β1mRNA表達的影響以及其在腎小球硬化發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI-1640培養(yǎng)基及新生小牛血清(FCS)為美國Gibco產(chǎn)品,軟脂酸(PA)及小牛血清蛋白(d-BSA)為美國 Sigma產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng) 大鼠腎小球系膜(HBZY-1)細胞購于鄭州大學生理教研室,用含 10%FCS、100 U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的 RPMI-1640培養(yǎng)液制成單個細胞懸液,接種于100 ml培養(yǎng)瓶內(nèi)。當 HBZY-1細胞長至 80%融合時,用 0.25%胰蛋白酶消化傳代,取第 11～14代 HBZY-1細胞用于實驗。37℃ 5%CO2100%濕度條件下培養(yǎng) 24 h,使細胞處于對數(shù)生長期,換成0.5%FCSRPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng) 24 h使細胞處于靜止期。

1.3 實驗分組 吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液,加入 PA使終濃度分別為25、100、400 μmol/L d-BSA,實驗重復 3次。

1.4 RT-PCR體系 按上述方法分組給藥,HBZY-1細胞繼續(xù)培養(yǎng) 72h,PBS沖洗 3次,加入 1ml Trizol RNA提取液,提取細胞總 RNA。根據(jù) A260/A 280值計算總 RNA濃度。ColⅣ、FN、TGF-β1mRNA的引物序列見表 1。引物由上海生物工程公司合成。在 25μl的反應(yīng)體系中含引物各 10 pmol/L,2.5μl的10×buffer,1mmol/Ld NTP,1μl Taq酶 ,變性 94℃ 1min,退火57℃ 1min,延伸 72℃ 1 min,35個循環(huán),72℃延伸 2min。

表1 ColⅣ、FN、TGF-β1 m RNA引物序列

1.5 PCR擴增產(chǎn)物電泳 取擴增產(chǎn)物 5μl加載樣緩沖液1μl,在含有 0.5μg/ml溴化乙啶的 2%瓊脂糖凝膠中電泳,標準物為DL2 000Marker。通過法國紫外凝膠成像系統(tǒng)分析電泳帶灰度。

1.6 ELISA法檢測培養(yǎng)上清液 ColⅣ、FN含量 將 5×104/ml HBZY-1細胞接種于 24孔微量板中培養(yǎng) 24 h,使細胞處于對數(shù)生長期,換成 0.5%FCS RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng) 24 h使細胞處于靜止期。加入軟脂酸 1 ml使終濃度分別為 25、100、400μmol/L d-BSA,繼續(xù)培養(yǎng) 72h,實驗重復 3次。

1.7 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)以x±s表示。對于正態(tài)分布的變量應(yīng)用單因素方差分析,偏相關(guān)分析用于在其他變量固定的條件下某兩個相關(guān)變量相關(guān)分析的檢驗;所有統(tǒng)計學處理均使用SPSS10.0軟件進行。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度 PA刺激對 HBZY-1細胞 ColⅣ、FN、TGF-β1mRNA表達的影響 以 25、100、400μmol/L PA刺激后,ColⅣ、FN、TGF-β1mRNA表達量均明顯升高,與 0μmol/L對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。ColⅣ、FN、TGF-β1mRNA表達量間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(均 P＜0.05)。HBZY-1細胞 ColⅣ、FN、TGF-β1mRNA表達量呈濃度依賴性升高,見圖 1和表 2。

圖1 ColⅣ、FN、TGF-β1 mRNA表達

表2 不同濃度 PA對 HBZY-1細胞 ColⅣ、FN、TGF-β1 mRNA表達的影響(x±s)

2.2 不同濃度 PA刺激對 HBZY-1細胞 ColⅣ、FN分泌水平的影響 以 25、100、400μmol/L PA刺激后,ColⅣ、FN分泌水平均明顯升高,與 0μmol/L對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。ColⅣ、FN分泌水平間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。PA促進 HBZY-1細胞合成分泌 ColⅣ、FN,并具有濃度依賴性。見表 3。

表3 不同濃度 PA對 HBZY-1細胞 ColⅣ、FN分泌的影響(x±s)

3 討 論

細胞外基質(zhì)(FN、ColⅣ、TGF-β1)是細胞生存的微環(huán)境,廣泛存在各種細胞表面,是構(gòu)成基底膜的主要成分。在人體的發(fā)育、細胞分化與遷移、信號傳導等生理過程和炎癥損傷與修復、免疫應(yīng)答以及腫瘤轉(zhuǎn)移病理過程中具有重要功能和作用〔1〕。長期以來,細胞一直是生物界研究疾病的重點。近年來,細胞外基質(zhì)在疾病的發(fā)生中所起的作用越來越受到重視。FFAs與腎小管間質(zhì)損傷密切相關(guān),是慢性腎臟疾病的一個進展因素。Kamijo等〔2〕報道 FFAs能導致腎小管間質(zhì)損傷。在腎病綜合征不是由于白蛋白而是由于結(jié)合了FFAs的白蛋白引起了腎小管損傷〔3〕。 Thomas等〔4〕通 過 大鼠 模 型研 究 發(fā)現(xiàn),白蛋白 結(jié)合FFAs組在巨噬細胞浸潤、細胞凋亡和皮質(zhì)細胞增殖方面均比白蛋白未結(jié)合組顯著。

本研究結(jié)果顯示,不同濃度 PA刺激 HBZY-1細胞后,ColⅣ、FN、TGF-β1mRNA表達量均明顯升高,并呈濃度依賴性。提示PA能促進系膜細胞外基質(zhì)基因的表達。同時還顯示HBZY-1細胞合成分泌 ColⅣ、FN水平也顯著增加,并呈濃度依賴性,表明PA能促進系膜細胞蛋白質(zhì)的合成。提示FFAs可能是腎小球硬化的一個誘導因素。

總之,在生理情況下腎小球內(nèi)細胞外基質(zhì)的合成和降解保持動態(tài)平衡,以維持正常的生理功能。當某些病理因素(糖尿病、腎病等)致FFAs增多,導致細胞外基質(zhì)合成增加或降解減少,造成細胞外基質(zhì)成分積聚,使細胞外基質(zhì)的大量堆積引起腎小球硬化發(fā)生、發(fā)展。

1 潘 琳,李光偉,郭艷茹,等 .細胞外基質(zhì)纖維連接蛋白和層黏連蛋白在糖尿病大鼠 DR微血管病變表達的研究〔J〕.中華糖尿病雜志,2004;12(1):56-8.

2 Kamijo A,Sugaya T,Hikawa A,et al.Urinary fatty acid bound to albumin aggravate tubulointerstitial damage〔J〕.Kindney Int,2002;62(12):1628-37.

3 Kamijo A,Sugaya T,Hikawa A,et al.Urinary fatty acid binging protein as a new clinical marker for the progression of chronic renal disease〔J〕.Rinsho Byori,2003;51(2):219-24.

4 Thomas ME,Harris KP,Walls J,et al.Fatty acid exacerbate tubulointerstitial injury in protein-over-load proteinuria〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2002;283(10):F640-7.