仇金鵬 李 澄 任 明 胡玉琳 佟 倜 王艷姝

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院麻醉科,吉林 長春 130021)

接觸過多的紫外線可以使人類的皮膚癌、白內(nèi)障等疾病的發(fā)病率升高。紫外線可以通過損傷皮膚細(xì)胞DNA,誘發(fā)自由基和細(xì)胞因子/炎癥趨化因子的產(chǎn)生,產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化損傷對(duì)皮膚造成光損傷導(dǎo)致皮膚衰老甚至引發(fā)皮膚癌〔1～3〕。雌激素作為一種甾體類激素,可以通過影響皮膚厚度、濕度、彈性、血管供應(yīng)、色素沉著來阻止皮膚老化,在抗皮膚衰老方面,有其獨(dú)到之處〔4,5〕,有研究表明雌激素可以抑制氧自由基(ROS)產(chǎn)生,減少氧化應(yīng)激,具有一定的抗氧化和抗凋亡作用〔6〕,然而對(duì)于雌激素對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)是否具有保護(hù)作用,通過什么途徑進(jìn)行保護(hù)還知之甚少。因此,本實(shí)驗(yàn)預(yù)先用雌二醇(17β-E2)處理 HaCaT細(xì)胞來觀察其對(duì)中波紫外線(UVB)照射導(dǎo)致細(xì)胞損傷的影響,探討雌激素的作用機(jī)制,為研究皮膚光老化發(fā)生中 17β-E2的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gibco,美國)、臺(tái)盼藍(lán)(Amresco,美國)、MDA試劑盒(南京建成)、DMSO(Sigma,北京鼎國分裝,美國)、FAC Scan流式細(xì)胞儀(Bection Dickinson FACScalibur,美國)、生物顯微鏡(CH型,OLYMPUS,日本)、UVB燈(15W,上海顧村光電儀器廠)、Fluo-3/AM(Biotium,美國)、羅丹明 123(Sigma,美國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HaCaT細(xì)胞在 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于含 10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基中。當(dāng)細(xì)胞融合至 85% ～90%時(shí)傳代,棄掉培養(yǎng)液,PBS沖洗 2遍,用 0.25%胰酶常規(guī)消化,用含血清的培養(yǎng)液迅速終止消化,制成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù),按 1×105接種于 100mm培養(yǎng)皿中備用。

1.2.2 分組及處理 當(dāng)培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞融合達(dá) 60%左右時(shí),將細(xì)胞隨機(jī)分為正常組、UVB組、17β-E2組。棄掉舊培養(yǎng)液,用高壓滅菌的 PBS沖洗 3遍后,正常組和 UVB組加入含 1%FBS的 10ml RPMI1640培養(yǎng)液,17β-E2組加入 5μl 0.2 mmol/L雌激素 +含 1%FBS的 10 ml RPMI1640培養(yǎng)液,放培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 24h后棄掉舊的培養(yǎng)液,用高壓滅菌的 PBS沖洗 3遍,向每個(gè)平皿內(nèi)加入 4 ml PBS,使之能浸沒整個(gè)平皿底。UVB組和17β-E2組打開平皿蓋在 15 W的 UVB燈正下方照射 6 min,正常組細(xì)胞用錫紙蓋住。照射后,立即棄掉平皿內(nèi)PBS,加入4ml 4℃預(yù)冷的 PBS沖洗 3遍。之后加入 RPMI1640培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng) 12h后收獲各組細(xì)胞備用。

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)鈣離子 ([Ca2+]i)濃度測(cè)定 將各組細(xì)胞常規(guī)消化后制成單細(xì)胞懸液,用 PBS調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)至 106個(gè) /ml。取含有 5×105個(gè)細(xì)胞的懸液至 1.5 ml微量離心管中;向微量離心管中加入 Fluo-3/AM Ester(終濃度 5μmol/L),混勻;在37℃孵箱中避光反應(yīng) 45 min后用 PBS洗滌 2次(1 500 r/min,5 min);在流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè),檢測(cè)條件為激發(fā)波長488nm、發(fā)射波長 530 nm。

1.2.4 細(xì)胞線粒體膜電位(△Ψm)測(cè)定 各組細(xì)胞消化后制成單細(xì)胞懸液,用PBS調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)至 106個(gè)/ml。取含有 5×105個(gè)細(xì)胞的上述細(xì)胞懸液至 1.5 ml微量離心管中;向微量離心管中加入 Rh123(終濃度5 mg/L),混勻;在 37℃孵箱中避光反應(yīng) 45 min后 PBS洗滌細(xì)胞 2次(1 500r/min,5 min);在流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè),檢測(cè)條件為激發(fā)波長488nm、發(fā)射波長530nm。

1.2.5 總超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定 細(xì)胞中 SOD能清除超氧陰離子自由基(),保護(hù)細(xì)胞免受損傷。受 UVB照射后的細(xì)胞超氧陰離子自由基增高,細(xì)胞中 SOD對(duì)自由基進(jìn)行清除從而含量減少?？裳趸u胺形成亞硝酸鹽,在顯色劑作用下呈紫紅色,用可見光分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。當(dāng)被測(cè)樣品中含有 SOD時(shí),則對(duì)有專一性抑制作用,使形成的亞硝酸鹽減少,比色時(shí)測(cè)定管的吸光度值低于對(duì)照管吸光度,通過公式可以計(jì)算出被測(cè)樣品中的SOD活力。

1.2.6 丙二醛(MDA)含量測(cè)定 采用硫代巴比妥酸反應(yīng)比色法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1 17β-E2對(duì)紫外線作用下 HaCaT細(xì)胞△Ψm和[Ca2+]i濃度的影響 與正常組比較,UVB組和 17β-E2組的△Ψm均顯著下降(P＜0.05);17β-E2組的△Ψm顯著高于 UVB(P＜0.05)。正常組的[Ca2+]i顯著低于 UVB照射組和 17β-E2組(P＜0.05);17β-E2組細(xì)胞的[Ca2+]i與 UVB組相比較,差異不顯著(P＞0.05)。見表 1。

表1 17β-E2對(duì)紫外線作用下 HaCaT細(xì)胞△Ψm和[Ca2+]i濃度的影響(n=3,x±s)

2.2 各組細(xì)胞MDA含量及SOD活性檢測(cè)結(jié)果 與正常組細(xì)胞比較,17β-E2組和 UVB照射組細(xì)胞 MDA含量均顯著升高(P＜0.05),SOD活性顯著下降(P＜0.05);與 UVB組細(xì)胞相比較,17β-E2組細(xì)胞 MDA含量顯著下降(P＜0.05),SOD活性顯著升高(P＜0.05)(見表 2)。

表2 17β-E2對(duì)紫外線作用下 HaCaT細(xì)胞氧化損傷的影響(n=3,x±s)

3 討 論

引起皮膚損傷的紫外線主要是長波紫外線(UVA)和UVB,而UVB對(duì)皮膚的損傷程度要比 UVA大 1 000倍。UVB的波長為 280～320 nm,隨著波長的增加,UVB對(duì)皮膚的穿透深度可達(dá) 0.01～10 mm,可作用的組織從表皮淺層到表皮深層,甚至真皮層〔7,8〕。UVB可通過輻射產(chǎn)生自由基,造成皮膚組織氧化損傷,被認(rèn)為是最主要的致癌紫外線波段〔9〕。雌激素是一種甾體類激素,主要來源于卵巢和腎上腺皮質(zhì),主要包括17β-E2、雌酮及其代謝產(chǎn)生的雌三醇等,其中 17β-E2作用最強(qiáng)。雌激素在抗皮膚老化、加速皮膚損傷修復(fù)、促進(jìn)毛發(fā)生長及抑制皮脂腺分泌等方面均發(fā)揮重要作用〔6〕。研究表明,雌激素也是一種損傷修復(fù)調(diào)節(jié)因子,在人類和動(dòng)物模型中,可以逆轉(zhuǎn)年齡相關(guān)的損傷愈合,局部或系統(tǒng)應(yīng)用雌激素能減輕炎癥反應(yīng),減少炎癥因子的產(chǎn)生,明顯提高機(jī)體的免疫反應(yīng),促進(jìn)傷口愈合〔10～12〕。雌激素不僅對(duì)年齡相關(guān)的皮膚老化起作用,對(duì)其他的物理因素(如光損傷)引起的老化也有明顯的修復(fù)作用,能夠通過保護(hù)血管內(nèi)皮抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成,還能中和氧自由基從而抑制脂質(zhì)過氧化過程〔6〕。本研究結(jié)果說明雌激素能夠提高△Ψm,降低[Ca2+]i濃度,維持線粒體的氧化磷酸化,減少內(nèi)源性自由基的產(chǎn)生,同時(shí)降低細(xì)胞內(nèi)由于照射產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 MDA的含量,從而抑制脂質(zhì)過氧化作用,減輕UVB對(duì)細(xì)胞的損傷,拮抗紫外線所致的皮膚損傷作用,對(duì)皮膚細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。

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