徐 杰,王玉飛,汪舟佳,喬 鳳,鐘志軍,3,杜昕穎,趙 瑾,曲 勍,高 嵐,陳澤良*

(1.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,甘肅蘭州 730000;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所,北京 100071;3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇南京 210095)

布魯菌外膜蛋白Omp31原核表達(dá)及抗原性分析

徐 杰1,2,王玉飛2,汪舟佳2,喬 鳳2,鐘志軍2,3,杜昕穎2,趙 瑾2,曲 勍2,高 嵐1*,陳澤良2*

(1.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,甘肅蘭州 730000;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所,北京 100071;3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇南京 210095)

克隆羊布魯菌的外膜蛋白Omp31基因,在大腸埃希菌中表達(dá)、純化,并對(duì)Omp31蛋白的抗原性進(jìn)行分析。以羊布魯菌的染色體DNA為模板,擴(kuò)增Omp31基因,雙酶切后克隆至pET32a上,在大腸埃希菌ER2566(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá),組氨酸結(jié)合樹(shù)脂柱純化,Western blot鑒定Omp31蛋白的抗原性。將Omp31克隆至載體pET32a,提取的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定、雙酶切鑒定和測(cè)序分析確定目的基因成功插入到了克隆載體中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于大腸埃希菌ER2566(DE3)中表達(dá)獲得HIS融合蛋白,SDS-PAGE分析證明,表達(dá)產(chǎn)物為43 ku的融合蛋白。Western blot結(jié)果表明,表達(dá)的蛋白具有與布魯菌外膜蛋白相同的抗原性。

布魯菌;Omp31蛋白;原核表達(dá);抗原性

布魯菌病(Brucellosis)簡(jiǎn)稱(chēng)布病,是由布魯菌(Brucella)侵入機(jī)體引起的傳染-變態(tài)反應(yīng)性的人畜共患傳染病。布病在世界各地都有廣泛流行,該病不僅損害人類(lèi)健康,還影響著乳、肉及其制品、皮毛、醫(yī)藥等在內(nèi)的民生需求,影響畜牧業(yè)發(fā)展和百姓致富,乃至國(guó)際貿(mào)易及旅游事業(yè)。而且它引起的人類(lèi)波浪熱、慢性感染以及反芻動(dòng)物流產(chǎn)和睪丸炎等,至今尚無(wú)根治方法[1]。我國(guó)人、畜布病波及24個(gè)省市、自治區(qū)和直轄市。2008年全國(guó)共報(bào)告人間布病病例28 281例,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)歷史上發(fā)病人數(shù)最多的1963年(12 097例)。

人間布病發(fā)病率的回升與動(dòng)物間布病的發(fā)病率呈正相關(guān),能反映動(dòng)物布病的波動(dòng),這些數(shù)據(jù)表明,我國(guó)動(dòng)物布病防治形勢(shì)非常嚴(yán)重。接種布魯菌疫苗是預(yù)防布病的最有效的手段,而準(zhǔn)確的診斷則是有效控制和消滅布病的前提,但目前常用的布病血清學(xué)診斷方法不能區(qū)分是疫苗免疫還是自然感染后引起的血清學(xué)反應(yīng)。研制具有標(biāo)記性的疫苗或?qū)ふ液线m的布魯菌診斷性抗原具有重要的意義。近年來(lái)尋找具有抗原保護(hù)作用的布魯菌診斷抗原一直是人們的目標(biāo),所以具有抗原保護(hù)作用的布魯菌外膜蛋白就成了研究的熱點(diǎn)。Omp31是OmpA家族成員之一,是布魯菌的重要外膜蛋白,在維持細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中發(fā)揮著重要作用[2-3]。本研究克隆了羊布魯菌的Omp31基因,在大腸埃希菌ER2566(DE3)中表達(dá),用復(fù)性純化的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blotting分析。本試驗(yàn)為尋找布病的診斷性蛋白和布魯菌基因缺失標(biāo)記苗的研制提供了可供的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒載體 布魯菌B.melitensis55009購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所[4-5];大腸埃希菌ER2566(DE3)購(gòu)自New England Biolabs公司;E.coliDH5α、pET32a質(zhì)粒為解放軍疾病預(yù)防控制所傳染病控制中心實(shí)驗(yàn)室保存和提供。

1.1.2 試劑盒、酶和試劑 PCR產(chǎn)物回收試劑盒、DNA膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自天根公司,各種限制性?xún)?nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司;Taq酶和T4DNA連接酶購(gòu)自NEB公司;DNA Marker、蛋白Marker購(gòu)自全式金公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 Omp31的PCR擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建從GenBank中下載B.melitensis16M 的序列,使用Primer Premier 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),其中上游引物Omp31-E-F(AGCTGGATCCGTGGT TGT TTCTGAACC)的5′端添加BamHⅠ酶切位點(diǎn),下游引物Omp31-E-R(AGCTAAGCTTGAACT TGTAGTTCAGACC)的5′端添加HindⅢ酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增的目的基因?yàn)?657 bp,編碼 219個(gè)氨基酸。提取B.melitensis55009的基因組DNA作為模板,用Omp31-E-F和Omp31-E-R擴(kuò)增omp31基因。PCR產(chǎn)物純化后,用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后與同樣酶切處理的pET32a連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α,得到pET32a-Omp31。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切鑒定正確后,測(cè)序確定序列的正確性。

1.2.2 重組蛋白表達(dá) 將鑒定為陽(yáng)性的pET32a-Omp31轉(zhuǎn)化大腸埃希菌ER2566中,挑取單克隆接入含氨芐青霉素的 LB液體培養(yǎng)基中,用0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo),同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照,SDSPAGE檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。陽(yáng)性菌株進(jìn)行大量誘導(dǎo),超聲裂解破碎后,分別收集上清和沉淀,進(jìn)行SDS-PAGE,對(duì)融合蛋白進(jìn)行可溶性分析。

1.2.3 重組蛋白的純化 用5倍柱體積的細(xì)胞裂解液(50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,20 mmol/L imidazole,pH8.0)平衡Ni-NTA離子親和交換凝膠柱。將菌體超聲破碎后的上清上樣,流速控制在1 mL/min以?xún)?nèi)。上樣完畢后,再用5倍柱體積的洗滌緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,50 mmol/L imidazole,pH 8.0)進(jìn)行洗滌;最后用洗脫緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,250 mmol/L imidazole,pH 8.0)洗脫目的蛋白,收集洗脫后的樣品進(jìn)行透析去鹽和120 g/L的SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4 重組蛋白的抗原性檢測(cè) 用Western blot分析重組蛋白的免疫原性。純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后,通過(guò)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜,用含50 g/L脫脂奶粉的TBST封閉過(guò)夜,用TBST漂洗后,用本實(shí)驗(yàn)室純化的兔抗布魯菌抗體為一抗,同時(shí)設(shè)正常兔血清作為對(duì)照,室溫孵育1 h,漂洗后,加入1∶1 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗,室溫孵育1 h,漂洗后將膜浸入DAB底物溶液中,至目的條帶清晰時(shí)終止反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 pET32a-Omp31原核表達(dá)載體的構(gòu)建

擴(kuò)增的特異目的片段長(zhǎng)約657 bp(圖1),純化后的PCR產(chǎn)物后用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后,與同樣酶切處理的pET32a連接,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。氨芐平板上長(zhǎng)出來(lái)的克隆,菌落PCR鑒定陽(yáng)性后,提取質(zhì)粒,BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定,可切出載體帶和657 bp的克隆片段(圖2)。酶切鑒定陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定,測(cè)定結(jié)果表明所克隆的序列與GenBank中的羊布魯菌16 M的Omp31(BMEI0844)基因序列完全相同。

圖1 omp31基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR product of omp31 gene

圖2 pET32a-Omp31雙酶切鑒定Fig.2 The enzyme digestion identification of recombinant plasmid pET32a-Omp31

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET32a-Omp31轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌E.c oliER2566(DE3)中,經(jīng) IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行 SDSPAGE電泳分析,同時(shí)設(shè)誘導(dǎo)前陰性對(duì)照,考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)果表明其表達(dá)產(chǎn)物的分子質(zhì)量在30 ku～50 ku之間,與預(yù)測(cè)的分子質(zhì)量43 ku相符(圖3)。離心收集少量誘導(dǎo)后的菌體,用去離子水懸浮,超聲破碎后,分別收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳,結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在(圖3)。

圖3 含pET32a-omp31表達(dá)質(zhì)粒菌株的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.3 T he expressed products of recobinant plasmid pET32a-Omp31(ER2566)by IPTG

圖4 重組蛋白的純化Fig.4 The purification of rOmp31 protein

2.3 重組蛋白的純化

重組蛋白的陽(yáng)性菌株大量誘導(dǎo)后,離心收集菌體,用PBS懸浮,超聲裂解破碎,分別收集上清和沉淀。將上清經(jīng)Ni-NTA離子交換樹(shù)脂親和純化,并進(jìn)行SDS-PAGE電泳,顯示清晰的目的條帶(圖4)。

2.4 免疫印跡分析

表達(dá)重組蛋白的宿主菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜,采用本室純化的兔抗布魯菌IgG抗體作為一抗,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體為二抗進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果表明誘導(dǎo)后在表達(dá)重組蛋白的位置上有一條特異的反應(yīng)條帶(圖5),說(shuō)明重組蛋白可與抗布魯菌抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。研究結(jié)果表明純化的重組蛋白具有與相應(yīng)天然蛋白相同的抗原性。

圖5 重組蛋白的Western blot檢測(cè)Fig.5 The results of Western blot of recombinant protein

3 討論

布魯菌病在世界范圍內(nèi)廣泛流行,是全球特別是發(fā)展中國(guó)家面臨的非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題,嚴(yán)重影響著人類(lèi)健康和畜牧業(yè)發(fā)展。布魯菌侵入動(dòng)物的生殖系統(tǒng),引起母畜的流產(chǎn)、公畜睪丸炎不育和各種組織的損害為特征。人布病常因誤診而轉(zhuǎn)變成慢性,反復(fù)發(fā)作,長(zhǎng)期的多種抗生素治療卻無(wú)法根治。人間布病是因直接接觸布病病畜、未徹底滅菌病畜污染的奶制品等而感染[6]?？刂撇疾〉年P(guān)鍵是及時(shí)檢驗(yàn)和免疫動(dòng)物,消除動(dòng)物傳染源。一方面,要建立快速而準(zhǔn)確的布病診斷方法;另一方面,則要做好疫苗免疫和病畜的淘汰工作。因此,建立疫苗免疫后區(qū)分自然感染和疫苗免疫的方法,及時(shí)免疫和淘汰變得尤為重要和迫切。基因缺失標(biāo)記疫苗通過(guò)缺失一個(gè)或幾個(gè)布魯菌保守性的基因,在不影響疫苗免疫保護(hù)作用的條件下,可通過(guò)檢測(cè)缺失基因的存在與否達(dá)到區(qū)別和鑒定的目的,從而能夠及時(shí)淘汰感染的病畜[7]。Omp31蛋白是OmpA家族的成員,在保持外膜結(jié)構(gòu)完整性、抵御多種殺菌環(huán)境中起著重要作用。Omp31是布魯菌的一個(gè)免疫保護(hù)性抗原,可用于布魯菌的鑒定[8]。布魯菌的Omp31基因缺失株沒(méi)有改變細(xì)菌的生物學(xué)特性[9]。因此,大腸埃希菌外源表達(dá)的Omp31蛋白作為檢測(cè)抗原在布病的血清學(xué)檢測(cè)中具有重要意義。本試驗(yàn)擴(kuò)增布魯菌外膜蛋白Omp31的基因,并原核表達(dá)Omp31蛋白,證明Omp31蛋白具有特異的免疫反應(yīng)原性,是一種非常好的布魯菌診斷抗原。同時(shí)本試驗(yàn)也為后期的蛋白功能鑒定和基因缺失標(biāo)記疫苗株的研制奠定了基礎(chǔ)。

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Expression and Antigenicity Analysis of the Omp31 Protein ofBrucella melitensis

XU Jie1,2,WANG Yu-fei2,WANG Zhou-jia2,QIAO Feng2,ZHONG Zhi-jun2,3,DU Xin-ying2,ZHAO Jin2,QU Qing2,GAO Lan1,CHEN Ze-liang2

(1.College of Lif e Science,Lanzhou University,Lanzhou,Gansu,730000,China;2.Institute of Disease Control and Prevention,Academy of Military Medical Science,Beijing,100071,China;3.College of Veterinary Medicine,Nanjing Agricultural University,N anjing,J iangsu,210095,China)

In order to clone and express the Omp31 protein ofB.melitensisinE.coli,purify the expressed protein and detect its immunogenicity.A gene recoding outer membrane protein 31-34 ku(Omp31)was amplified from the genomic DNA ofB.melitensisby PCR.The amplified fragments were digested withBamHⅠandSalⅠ,and then cloned to the vector pET32a.The constructed recombinant plasmid pET32a-Omp31 was transformed toE.coliER2566(DE3)and was induced to express the fusion protein.Then the protein was purified by histidine-binding resin column chromatography,and the immunogenicity was detected by Western blot.The PCR product of Omp31 gene was cloned to the vector pET32a,and the recombinant vector was confirmed by colony PCR identification,recombinant vector digested identification and sequencing analysis.It was successfully expressed inE.coliER2566(DE3)as a fusion protein with histidine at the presence of IPTG,and a specific protein band of 43 ku was found when identified by SDSPAGE.Western blot showed good immunoreactivity of the expressed product.Omp31 was successfully cloned and expressed,and the purified fusion protein had immunogenicity.This study provides a solid foundation for the further study on the function of proteins and brucellosis diagnostic antigens.

Brucella;omp31;prokaryotic expression;antigenicity

S852.614;Q786

A

1007-5038(2010)01-0017-04

2009-08-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30600024);國(guó)家＂863＂資助項(xiàng)目(2007AA02Z412)

徐 杰(1983-),男,山東泰安人,碩士研究生,主要從事病原菌基因工程研究 。*通訊作者